盧曉明 張珍濤 李寧陽 陶夢哲 喬旭光

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東泰安271018）

大蒜（Allium sativum L.），別名獨(dú)蒜、葫蒜、葫等，是蔥科蔥屬植物。我國是大蒜的主要生產(chǎn)國之一，年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的四分之三，在國際大蒜市場上具有舉足輕重的地位。大蒜常用來鮮食，此外還加工成蒜泥、脫水蒜片、蒜汁等制品[1]，其中脫水蒜片是大蒜加工的重要產(chǎn)品之一，對出口創(chuàng)匯、穩(wěn)定我國大蒜價(jià)格、保障大蒜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展起到重要作用，其產(chǎn)量及出口量逐年上升。2018年我國大蒜年產(chǎn)量為2 227 萬t，而每年的大蒜加工量約30 萬t，其中出口大約16.4 萬t。

在大蒜脫水生產(chǎn)加工過程中，清洗、漂洗和脫水等過程均會(huì)產(chǎn)生大量廢水，其廢水中含有大量的多糖、蛋白質(zhì)、蒜氨酸等成分，是大蒜加工過程中的主要副產(chǎn)物[2]?，F(xiàn)行生產(chǎn)中每生產(chǎn)1 t 脫水蒜片，需消耗30～40 t 水[3]。大蒜加工廢水是一種高濃度的有機(jī)廢水，富含多種成分，尤其含有大蒜素，對細(xì)菌具有很強(qiáng)的殺傷力，因此會(huì)對后面的生化處理造成嚴(yán)重干擾[4]。據(jù)估算，每年全國蒜片加工廢水中流失的大蒜蛋白約2.4 萬t，大蒜多糖約3萬t，大蒜素約120 萬t[5]。如果對蒜片加工廢水進(jìn)行高值化利用，將其中含有的功能成分提取分離，經(jīng)純化后即可作為高附加值的保健食品和醫(yī)藥原料。

大蒜廢水蛋白是指從大蒜切片廢水中提取的多種蛋白質(zhì)的總稱。本文針對大蒜廢水蛋白的分子質(zhì)量大小，采用膜分離的方式對其成分組成、分子質(zhì)量分布、氨基酸組成及其它理化性質(zhì)進(jìn)行研究，旨在對蒜片加工副產(chǎn)物進(jìn)行高值化利用，不僅節(jié)約了資源，變廢為寶，而且可大大降低生產(chǎn)成本。此外，對大蒜蛋白性質(zhì)的研究將為大蒜蛋白深加工提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜加工廢水；金龍魚牌大豆油（食品級(jí)），益海嘉里食品營銷有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮蘭G250、硼酸、硫酸銅、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、濃硫酸等均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

流動(dòng)分析儀，濟(jì)南博納生物科技有限公司；Orion 868 型pH 測試儀，梅特勒-托利多有限公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；LXJ-IIB 型低速大容量多管離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Adventure 電子天平，奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；IKA T18 分散機(jī)，艾卡儀器設(shè)備有限公司；Bio-Rad 電泳儀，伯樂生命科技有限公司；DSC 200PC 型差示量熱掃描儀，德國耐馳公司；紅外光譜儀，賽默飛世爾科技公司；L8900 型氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大蒜廢水蛋白的分離 采用分子質(zhì)量為10 ku 和30 ku 的膜過濾組件對大蒜廢水進(jìn)行分級(jí)分離，測定每段廢水中總糖和蛋白的含量，確定大蒜廢水蛋白的膜分離條件。采用膜分離與酸沉相結(jié)合的方法制備大蒜蛋白，將獲得的大蒜廢水蛋白真空凍干備用。

1.3.2 大蒜廢水蛋白組成測定 蛋白質(zhì)含量的測定采用凱氏定氮法（GB 5009.5-2016）；水分含量測定采用直接干燥法（GB 5009.3-2016）；脂肪含量的測定采用索氏提取法（GB 5009.6-2016）；灰分含量的測定采用馬弗爐灼燒 （GB 5009.4-2016）；總糖的測定采用苯酚硫酸法[6]。

1.3.3 大蒜廢水蛋白分子質(zhì)量測定 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE） 測定大蒜廢水蛋白的分子質(zhì)量。具體測定方法如下[7-8]：配制20 mg/mL 的大蒜廢水蛋白溶液，并與兩倍樣品緩沖液1∶1 加入離心管，沸水中加熱3 min，然后12 000 r/min 離心1 min，取20 μL 上清液上樣。采用10 mA 電流恒流電泳，當(dāng)溴酚蘭指示劑前沿線到達(dá)分離膠底部約1 mm時(shí)停止電泳。將凝膠用考馬斯亮蘭R250 染色液染色3 h 后脫色。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量確定大蒜廢水蛋白的分子質(zhì)量分布。

1.3.4 大蒜廢水蛋白氨基酸組成分析 參照GB/T 5009.124-2016 中的方法，采用L8900 型全自動(dòng)氨基酸分析儀測定大蒜廢水蛋白中的氨基酸組成。按照式（1）計(jì)算。

式中，X——待測蛋白氨基酸含量（g/100 g）；C——待測液中氨基酸含量 （nmol/50 μL）；F——試樣稀釋倍數(shù)；V——水解后試樣定容體積（mL）；M——氨基酸分子質(zhì)量；m——試樣質(zhì)量（g）。

1.3.5 大蒜廢水蛋白等電點(diǎn)（PI）的測定 根據(jù)蛋白質(zhì)分子在等電點(diǎn)時(shí)溶解性最小，容易聚集沉淀的原理測定大蒜廢水蛋白的等電點(diǎn)。具體方法[9]如下：按照表1中的試劑配比依次加入各種試劑后混合均勻，靜置一段時(shí)間后離心，取上清液測定280 nm 波長下的吸光度。

表1 試劑配比Table 1 The reagent ratio

1.3.6 差示量熱掃描（DSC）分析 準(zhǔn)確稱取5 mg大蒜廢水蛋白放入鋁質(zhì)樣品盒中，加蓋壓緊后置于測量池中。升溫速率為5 ℃/min，吹掃氮?dú)饬髁繛?0 mL/min，測量范圍為25～180 ℃。用proteus軟件進(jìn)行圖譜采集和數(shù)據(jù)分析。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析 參考Liu 等[10]的研究方法，取5 mg 大蒜廢水蛋白與200 mg KBr 研磨均勻，壓片，采用傅里葉紅外光譜儀對蛋白進(jìn)行紅外掃描。掃描范圍：4 000～400 cm-1；分辨率：4 cm-1。掃描次數(shù)：32 次。用Opus 6.5 軟件分析。

1.3.8 大蒜廢水蛋白溶解性測定 稱取0.5 g 大蒜廢水蛋白，加入30 mL 蒸餾水，分別調(diào)節(jié)pH、溫度、鹽濃度，室溫下磁力攪拌60 min，5 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移并定容至50 mL。測定氮溶解指數(shù)。具體計(jì)算公式如下：

式中，N1——樣品中水溶性蛋白含量（mg）；N2——樣品粗蛋白含量（mg）。

1.3.9 蛋白質(zhì)乳化性及乳化穩(wěn)定性測定 配制60 mL 0.4%的蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH 值分別為2，4，6，8，10，12，加入10 mL 大豆油，10 000 r/min 下均質(zhì)1 min。準(zhǔn)確吸取50 μL 底部乳狀液于試管中，立即加入10 mL 0.1%的SDS 溶液，充分混勻后，在500 nm 波長處測定吸光度值A(chǔ)1，乳化性以乳化活性指數(shù)EAI 表示[11-12]，10 min 后，再次測定其吸光度A2，乳化穩(wěn)定性以ES 表示，按式（3）、式（4）計(jì)算。

1.3.10 蛋白質(zhì)起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定 配制50 mL 1%的蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH 值分別為2，4，6，8，10，12，測定其在100 mL 量桶中的高度為h1，10 000 r/min 下均質(zhì)1 min 后立刻轉(zhuǎn)移至量桶內(nèi)，測定此時(shí)泡沫高度為h2，靜置30 min，測定泡沫高度為h3，計(jì)算起泡性和泡沫穩(wěn)定性[13-14]。按式（5）、式（6）計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次。采用Excel 軟件作圖，并采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜廢水主要成分的分子質(zhì)量分布

大蒜加工廢水中主要含有大蒜多糖及蛋白質(zhì)兩種成分，采用膜過濾方式對其分子質(zhì)量分布進(jìn)行研究。從圖1可以看出大蒜加工廢水中蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量主要分布在30 ku 以上，含量占總蛋白含量的99.50%；而對比糖類物質(zhì)的分子質(zhì)量分布發(fā)現(xiàn)其主要分布在30 ku 以下，占到總糖含量的83.48%，特別是分子質(zhì)量在10 ku 以下的糖類含量占總糖含量的54.13%。從結(jié)果可以看出，大蒜蛋白質(zhì)與糖類的分子質(zhì)量分布不同，采用30 ku 的膜過濾組件結(jié)合酸沉法可以基本達(dá)到糖類與蛋白質(zhì)分離的目的。

圖1 大蒜廢水總糖和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布Fig.1 Mw distribution of total sugar and protein in garlic wastewater

2.2 大蒜廢水蛋白成分分析

從表2可以看出，采用膜分離與酸沉相結(jié)合的方法獲得的大蒜廢水蛋白含量達(dá)72%以上，還含有水分、糖類等其它物質(zhì)，特別是糖類物質(zhì)含量占到13.49%，推測原因?yàn)槠渑c蛋白質(zhì)結(jié)合形成糖蛋白，在膜過濾的過程中難以分離。

表2 大蒜廢水蛋白組成成分Table 2 Constituent compositions of garlic protein

2.3 大蒜廢水蛋白的等電點(diǎn)

由圖2可知，當(dāng)pH=3.86 時(shí)，吸光度值最低，意味著此時(shí)上清液中蛋白質(zhì)含量最少；而當(dāng)pH＜3.86 時(shí)，隨pH 值的增加吸光度逐漸減??；pH＞3.86 時(shí)，隨pH 值的增加吸光度逐漸增大；由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處溶解度最低，使得溶液中的蛋白吸光度最低，可得大蒜廢水蛋白的等電點(diǎn)為3.86。

2.4 大蒜廢水蛋白的分子質(zhì)量

對大蒜廢水蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 分析，由圖3可知，大蒜廢水蛋白結(jié)構(gòu)中形成了2 條條帶，分子質(zhì)量分別為31.9 ku 和48.4 ku，其中48.4 ku 的條帶著色較深，相對含量較高。有研究結(jié)果顯示從大蒜中分離的可溶性蛋白分子質(zhì)量主要在10～55 ku 范圍內(nèi)[15]，本文分離得到的條帶均在此范圍內(nèi)。

圖2 大蒜廢水蛋白的等電點(diǎn)Fig.2 Isoelectric point of protein in garlic wastewater

2.5 大蒜廢水蛋白氨基酸組成分析

由表3可以看出，大蒜廢水蛋白中約含有16種氨基酸，其中含量最高的氨基酸為谷氨酸，占大蒜廢水蛋白含量的10.87%，谷氨酸在生物體的蛋白質(zhì)代謝過程中占重要地位，參與動(dòng)植物及微生物的許多重要化學(xué)反應(yīng)，是生物體內(nèi)氮代謝的基本氨基酸之一[16]。氨基酸含量次之的為天冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸等，其中，亮氨酸缺乏會(huì)導(dǎo)致低血糖[17]，賴氨酸能夠促進(jìn)胃酸分泌，增強(qiáng)食欲。而大蒜廢水蛋白中具有防癌、抗癌活性的含硫氨基酸（甲硫氨酸和半胱氨酸）含量較低。

氨基酸評分值越接近100，與WHO/FAO 評分模式氨基酸組成越接近，蛋白質(zhì)價(jià)值就越高。由表4可知，甲硫氨酸評分為26.28，是該蛋白的第一限制氨基酸；賴氨酸評分為104.72，高于魚（75）、大豆（46）、花生（43）、糙米（56）、全粒小麥（48）、全粒玉米（40）、馬鈴薯（48）的氨基酸評分[18]。因此，將大蒜蛋白作為一種食物輔料加入到各種食品中會(huì)大大提高其營養(yǎng)價(jià)值。

2.6 大蒜廢水蛋白熱穩(wěn)定性分析

圖3 蛋白質(zhì)的SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of proteins

表3 大蒜廢水蛋白的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of protein in garlic wastewater

表4 大蒜廢水蛋白必需氨基酸氨基酸組成評價(jià)Table 4 Amino acid score （AAS） of garlic wastewater protein

圖4是大蒜廢水蛋白熱變性曲線。一般來說，蛋白樣品在升溫過程中結(jié)構(gòu)若發(fā)生變化，樣品吸熱，在DSC 曲線上會(huì)產(chǎn)生一個(gè)吸熱峰，DSC 曲線上顯示的轉(zhuǎn)變溫度即蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變的溫度[19]，可表征蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。熱焓即焓變，是樣品發(fā)生轉(zhuǎn)變前、后的ΔH（圖中吸熱峰的峰面積）與蛋白質(zhì)有序二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量有關(guān)[20]。一般來說，蛋白熱變性焓越小，蛋白質(zhì)變性程度越小。由圖4大蒜分離蛋白熱變性曲線可以看出，其變性溫度為73.2℃，熱焓變?chǔ) 為11.87 J/g。圖3中吸熱峰的出現(xiàn)表明大蒜廢水蛋白分子由于加熱而經(jīng)歷解折疊，即從天然態(tài)到變性態(tài)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程，蛋白質(zhì)變性溫度與其β-折疊結(jié)構(gòu)含量呈正相關(guān)，蛋白質(zhì)變性過程中熱能的變化主要源于分子間氫鍵的斷裂[21-25]，大蒜廢水蛋白的變性焓較高，證明其有序結(jié)構(gòu)所占比例較高。

2.7 大蒜廢水蛋白FT-IR 分析

由圖5可見，酰胺A 帶出現(xiàn)在3 270 cm-1處，而且只有一個(gè)吸收峰，說明是仲胺的伸縮振動(dòng)。酰胺I 區(qū)（1 600～1 700 cm-1）蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)彼此重疊。而酰胺III 區(qū)（1 220～1 330 cm-1）不受水分子的干擾。在1 340～1 290 cm-1范圍內(nèi)，屬于α-螺旋結(jié)構(gòu)，大蒜廢水蛋白在1 310 cm-1處具有吸收峰，表明其存在α-螺旋結(jié)構(gòu)；在1 248～1 220 cm-1范圍內(nèi)，屬于β-折疊結(jié)構(gòu)[26]，大蒜廢水蛋白在1 240 cm-1處具有吸收峰，表明其存在β-折疊結(jié)構(gòu)；比較兩者吸收峰的相對強(qiáng)度，可以看出大蒜蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)所占比例遠(yuǎn)大于α-螺旋結(jié)構(gòu)，這與岳晶念[27]研究基本一致。

圖4 大蒜廢水蛋白的熱變性曲線Fig.4 Thermal denaturation curve of protein in garlic wastewater

圖5 大蒜廢水蛋白紅外光譜圖譜Fig.5 FT-IR spectra of protein in garlic wastewater

2.8 大蒜廢水蛋白基本性質(zhì)

圖6 不同pH 下大蒜廢水蛋白的溶解性Fig.6 Effects of pH on NSI of protein

2.8.1 大蒜廢水蛋白溶解性 蛋白質(zhì)溶解性的高低會(huì)影響蛋白質(zhì)生理功能的強(qiáng)弱，而在不同pH 條件下其溶解性不同。由圖6可知，隨著溶液pH 值的升高，大蒜廢水蛋白的溶解性呈先降低后升高的趨勢，在pH 4.0 大蒜廢水等電點(diǎn)附近時(shí)，大蒜廢水蛋白溶解性最低，在等電點(diǎn)左側(cè)，溶解度隨著pH 值的升高而降低，在等電點(diǎn)右側(cè)隨著pH 值的升高而升高。當(dāng)pH 在等電點(diǎn)的兩側(cè)時(shí)，蛋白質(zhì)分別以負(fù)離子和正離子的狀態(tài)存在，相互之間的斥力作用和水合作用能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解。當(dāng)pH值大于10.0 時(shí)，大蒜廢水蛋白的溶解度超過80%，這與大蒜廢水中含有較多的堿性蛋白有關(guān)，總體來說，在堿性條件下，大蒜廢水蛋白的溶解性優(yōu)于其在酸性條件下的溶解性。

2.8.2 大蒜廢水蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性 蛋白質(zhì)具有乳化劑的特征結(jié)構(gòu)，在蛋白質(zhì)的分子中同時(shí)含有親水和親油基團(tuán)，降低水和油的表明張力。此外，蛋白質(zhì)還能降低水和空氣中的表面張力，即存在乳化穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)的特殊結(jié)構(gòu)使其可以作為一種表面活性劑[28-29]。由圖7可以看出，在堿性條件下，大蒜廢水蛋白與大豆分離蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性基本一致；在酸性條件下，大蒜廢水蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性均高于大豆分離蛋白，且在pH 4 附近大蒜廢水蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性最低，由于蛋白質(zhì)的乳化性與溶解性成正相關(guān)，由蛋白分子表面帶電荷多少?zèng)Q定[30]。當(dāng)?shù)鞍兹芙庑孕r(shí)，蛋白無法與油脂形成乳化液。

2.8.3 大蒜廢水蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性 蛋白質(zhì)的起泡性是指能降低氣-液界面表面張力而幫助形成氣泡的能力[31]。泡沫穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)維持泡沫穩(wěn)定存在的能力。從圖8可以看出，大蒜廢水蛋白和大豆分離蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均隨pH 值的增加呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，且大豆分離蛋白的起泡性略高于大蒜廢水蛋白。在等電點(diǎn)附近（pH 4）時(shí)，大蒜廢水蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性最低，分別為63.55%和20.45%。而在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的條件下，大蒜廢水蛋白生成的泡沫細(xì)膩均勻，穩(wěn)定性較好。在偏離等電點(diǎn)的pH 條件下蛋白帶凈負(fù)或凈正電荷，從而導(dǎo)致分子間靜電斥力增加而削弱了分子的疏水相互作用，分子柔性增大，有利于其更快地吸附至氣液界面，從而增強(qiáng)起泡能力[32-33]。

圖7 溫度對乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of temperature on emulsification and emulsion stability

圖8 pH 對起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effects of pH on foaming and foam stability

3 結(jié)論

大蒜廢水中蛋白質(zhì)主要分布在30 ku 以上，而糖類主要分布在30 ku 以下，因此采用30 ku 的膜過濾組件可以達(dá)到分離的目的。通過膜過濾和酸沉相結(jié)合的方法得到純度為72.11%的大蒜廢水蛋白，其分子質(zhì)量為31.9 ku 和48.4 ku，由16種氨基酸組成，其中谷氨酸含量最多占10.87%，其次為天冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸，甲硫氨酸是該蛋白的第一限制性氨基酸。大蒜廢水蛋白的等電點(diǎn)為3.86；DSC 分析發(fā)現(xiàn)其變性溫度為73.2 ℃，熱焓變?chǔ) 為11.87 J/g；通過傅里葉變換紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)其具有α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)，且β-折疊結(jié)構(gòu)所占比例遠(yuǎn)大于α-螺旋結(jié)構(gòu)。對大蒜廢水蛋白基本性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)大蒜廢水蛋白具有良好的溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性。上述研究初步確立了大蒜廢水蛋白的基本性質(zhì)，為進(jìn)一步開發(fā)大蒜廢水蛋白，提高大蒜加工廢水附加值提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。