張石芬 陳曦 龔桃根 劉利明

（1 廣東省深圳市人民醫(yī)院病理科 深圳518020；2 廣東省婦幼保健院耳鼻喉科 廣州510010；3 廣東省深圳市人民醫(yī)院耳鼻喉科 深圳518020）

鼻咽癌屬于惡性上皮細胞腫瘤，多數(shù)患者在疾病早期已發(fā)生腫瘤侵襲或轉(zhuǎn)移，故而開展該疾病侵襲相關(guān)因子的研究，對疾病治療有重要幫助[1～2]。 本研究選取40 例鼻咽癌患者，采集其癌灶標本及癌旁標本， 探索干擾ROCK1 基因?qū)Ρ茄拾┑募毎忠u的影響。 現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016 年4 月～2019 年10 月收治的鼻咽癌患者40 例，其中男26 例，女14 例，年齡28～71 歲，平均（63.24±3.58）歲。 分別采集鼻咽癌標本、癌旁組織各40 份（每位患者采集1 份），由2 位病理科工作人員實施。

1.2 納入標準與排除標準

1.2.1 納入標準 （1）患者均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診，且未接受過化療；（2）患者臨床資料完整，患者及家屬同意資料用于臨床分析；（3）患者溝通能力、表達能力正常，具有基本刑事責任能力。

1.2.2 排除標準 （1）合并其他部位惡性腫瘤者；（2）有精神疾病病史者；（3）在參與研究前，接受過化療者。

1.3 研究方法

1.3.1 所用儀器、試劑 二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機、低溫冰箱、 電泳儀、 免疫組化檢測工具及試劑盒、ROCK1 抗體及二抗。

1.3.2 檢測分析 對標本實施石蠟包埋后，切片（厚度控制為4 μm），以載玻片放置切片，烘干機上行1 h 烘烤（溫度控制為60℃）；于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中分別浸泡5 min；乙醇梯度水化處理，于蒸餾水中浸泡2 min，以檸檬酸鹽抗原對其修復(fù)，置于室溫中，待其冷卻。 對每張玻片滴3%過氧化氫50 μl，室溫下靜置0.5 h，以緩沖液行3 次沖洗，每次沖洗時間控制為5 min。以10%山羊血清50 μl 對各切片封閉處理，室溫中靜置30 min。將ROCK1 抗體滴入各切片，于37℃下靜置2 h，以緩沖液行3 次沖洗，每次沖洗時間為3 min。 將二抗加入， 室溫下反應(yīng)30 min，以沖洗液沖洗，每次沖洗3 min，共3 次。 將鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶加入其中， 于室溫下靜置30 min。 以緩沖液再次沖洗，每次沖洗3 min，共3 次。 之后以新制二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，行3 min 顯色，于顯微鏡下對染色程度觀察，以自來水沖洗，將染色過程終止。 以沖洗液再次沖洗，每次沖洗3 min，共3 次。 以蘇木素行復(fù)染處理，在自來水下沖洗，用1%鹽酸對其行分化處理，以自來水對其再次沖洗，共5 min。 梯度脫水后烤干標本，以中性樹膠對其行封片處理后，顯微鏡下觀察。

1.3.3 干擾ROCK1 基因的處理 將鼻咽癌的細胞株（6-10B）放在培養(yǎng)基（RP-MI1640）中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為5%二氧化碳、37℃， 若細胞生長至融合度80%，實施細胞傳代培養(yǎng)，待細胞生長達到對數(shù)生長期，用ROCK1 抑制劑對細胞株進行處理（將抑制劑加入培養(yǎng)基即可），設(shè)置2 個濃度，分別是10 μM、30 μM。 藥物處理后靜置1 h，對細胞進行收集。 此后，以RIPA 裂解液（含1%苯甲基磺酰胺）對細胞行裂解處理，對總蛋白進行提取。 以BCA 法測定蛋白濃度，制作10% SDS-PAGE 凝膠，加入蛋白，上樣至孔中，垂直電泳，于全濕狀況下，轉(zhuǎn)PVDF 膜，以牛血清白蛋白封閉處理，將ROCK1 抗體加入，放置在4℃的環(huán)境中過夜，孵育。 在第2 天，用緩沖液對其沖洗3次，每次沖洗時間為5 min，之后以HRP 標記二抗行2 h 孵育， 再次用緩沖液沖洗3 次， 每次沖洗時間為5 min，用ECL 發(fā)光液對其處理，在暗室中進行曝光。

1.3.4 細胞侵襲處理 于Transwell 小室底部，將ECMatrix 膠鋪好， 將RP-MI1640 培養(yǎng)基加入其中，放置在培養(yǎng)箱內(nèi)（溫度設(shè)置成37℃）。 于小室下室，加RP-MI1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），上室加入相同培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中不含10%胎牛血清。 將一定細胞懸液加入到各孔，另外設(shè)置復(fù)孔3 個，培養(yǎng)24 h，染色處理并在室內(nèi)干燥。將小室放在載玻片上，用顯微鏡觀察，隨機選取5 個視野并照相，對細胞個數(shù)進行計算，以侵襲細胞的數(shù)量來評估其侵襲能力。

1.4 觀察指標 統(tǒng)計鼻咽癌與癌旁標本ROCK1表達情況， 對以不同方法干擾ROCK1 處理后的ROCK1 表達水平進行測定，測定癌細胞侵襲能力。

1.5 統(tǒng)計學方法 用SPSS20.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，采用F檢驗；計數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌標本與癌旁標本ROCK1 表達情況分析癌旁組織40 份中，ROCK1 陽性者3 份， 陽性率7.50%； 鼻咽癌組織40 份中，ROCK1 陽性者共19份，陽性率47.50%。 兩組比較差異顯著（χ2＝16.05，P＝0.000）。

2.2 ROCK1 表達情況 對6-10B 細胞株進行干擾ROCK1 處理后實施蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）檢測。 經(jīng)30 μM 濃度藥物處理的細胞株ROCK1 表達水平明顯低于未經(jīng)藥物處理的細胞株及經(jīng)10 μM 濃度藥物處理的細胞株（P＜0.05），經(jīng)10 μM 濃度藥物處理的細胞株ROCK1 表達水平明顯低于未經(jīng)藥物處理的細胞株（P＜0.05）。 見表1。

表1 ROCK1 表達情況（±s）

表1 ROCK1 表達情況（±s）

組別 n ROCK1 表達水平未經(jīng)藥物處理的細胞株經(jīng)10 μM 濃度藥物處理的細胞株經(jīng)30 μM 濃度藥物處理的細胞株40 40 40 2.54±0.31 1.28±0.12 0.68±0.14 F P 3.624 0.021

2.3 癌細胞侵襲能力 對6-10B 細胞株進行干擾ROCK1 處理后實施Transwell 小室實驗，在560 nm處記錄數(shù)值。 經(jīng)分析，經(jīng)30 μM 濃度藥物處理的細胞株癌細胞侵襲能力明顯低于未經(jīng)藥物處理的細胞株及經(jīng)10 μM 濃度藥物處理的細胞株（P＜0.05），經(jīng)10 μM 濃度藥物處理的細胞株癌細胞侵襲能力明顯低于未經(jīng)藥物處理的細胞株（P＜0.05）。 見表2。

表2 癌細胞侵襲能力（±s）

表2 癌細胞侵襲能力（±s）

組別 n 癌細胞侵襲能力未經(jīng)藥物處理的細胞株經(jīng)10 μM 濃度藥物處理的細胞株經(jīng)30 μM 濃度藥物處理的細胞株40 40 40 F P 172.55±16.34 128.65±15.25 66.31±12.38 5.152 0.018

3 討論

在病理分型方面， 鼻咽癌患者多數(shù)為低分化病理類型[3]，經(jīng)過化療、放療后，仍有20%的患者會出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)[4～5]，提示鼻咽癌細胞侵襲性對該病的復(fù)發(fā)有重要影響。

ROCK1 蛋白是Rho 相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）中的一種，可對細胞黏附、骨架重組發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，對細胞遷移及運動造成影響[6～7]。 有研究指出，ROCK1 高表達對腫瘤細胞侵襲能力有重要促進作用，而Rho/ROCK 信號通路，是發(fā)生細胞侵襲的重要途徑[8]。ROCK 蛋白和Rho GTP 結(jié)合之后，其構(gòu)象會出現(xiàn)變化，充分暴露其催化結(jié)構(gòu)域，此時ROCK可將下游效應(yīng)分子激活。

本研究為探索ROCK1 基因在鼻咽癌細胞侵襲中的作用， 選取40 例患者的癌旁組織與鼻咽癌組織， 發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織ROCK1 陽性率明顯高于癌旁組織， 可見在癌癥組織中ROCK1 基因呈現(xiàn)出高表達狀態(tài)。 對癌癥組織進行處理， 干擾ROCK1 表達后， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)30 μM 濃度、10 μM 濃度干擾ROCK1 處理后，標本ROCK1 表達水平、癌細胞侵襲能力均明顯下降，由此可見，干擾ROCK1 基因能夠?qū)Ρ茄拾┘毎那忠u能力造成直接影響。

綜上所述， 干擾ROCK1 基因可降低鼻咽癌的細胞侵襲能力，這可為鼻咽癌的治療提供重要思路，值得后續(xù)深入研究。