董 琪，蒲順昌，劉飛翔，孫志威

（亳州學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 亳州 236800）

大曲通過傳統(tǒng)工藝自然接種生產(chǎn)，是富集、培養(yǎng)有益微生物及其代謝產(chǎn)物的載體，因此大曲是多種微生物及酶的混合體系，包括細(xì)菌、酵母菌和霉菌[1]，在釀酒發(fā)酵過程中起著重要的糖化、發(fā)酵等作用[2]。在濃香型大曲中，酵母菌是關(guān)鍵的一類菌群，主要有釀酒酵母屬（Saccharomyces）、假絲酵母屬（Candida）、畢赤酵母屬（Pichia）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、漢遜酵母屬（Hansenula）、結(jié)合酵母屬（Zygosaccharomyces）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）和紅酵母屬（Rhodotorula）[3-5]，是產(chǎn)酒與生香的關(guān)鍵功能菌，影響白酒的出品率及其香味成分。因此，對(duì)大曲中功能性酵母菌的研究勢(shì)在必行[6]。

目前，對(duì)大曲酵母菌的研究多集中于酵母菌的分離、篩選及鑒定方面[7]，也有對(duì)篩選出的釀酒酵母的耐高溫、耐乙醇、耐酸等特性研究[8-13]。將耐高溫、耐酒精等耐受性較好且產(chǎn)生較好風(fēng)味的酵母應(yīng)用到濃香型白酒生產(chǎn)中，有利于提高白酒品質(zhì)和縮短發(fā)酵周期，對(duì)維持夏季的正常生產(chǎn)具有重要的意義[14-15]。有學(xué)者[16]從大曲中分離出2株耐性較好的優(yōu)良菌株，并將其應(yīng)用到釀酒生產(chǎn)中，取得良好的效果。

本研究以濃香型大曲為研究對(duì)象，采用稀釋涂布平板法從中分離酵母菌，對(duì)其形態(tài)特征進(jìn)行觀察；采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）顯色法初篩，通過發(fā)酵力、產(chǎn)酒能力、耐高溫、耐酒精能力實(shí)驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩，篩選一株優(yōu)良的功能性酵母菌，利用Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行鑒定，并利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（head space solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPMEGC-MS）對(duì)其液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析，以篩選出優(yōu)良的功能酵母菌，豐富菌種資源，為濃香型白酒的品質(zhì)提升提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大曲：亳州市某酒廠。YT鑒定板：美國(guó)Biolog公司。

1.1.2 主要試劑

2,3,5-氯化三苯基四氮唑（純度≥98.0%）：青島海博生物技術(shù)有限公司；無水乙醇（純度≥99.7%）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母膏10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.0～5.5，115 ℃滅菌20 min。YPD固體培養(yǎng)基中添加20 g/L瓊脂粉，115 ℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[17]：取高粱粉1.8 kg，加蒸餾水7.2 L，蒸煮糊化90 min，取出，待溫度降至90 ℃時(shí)加入2%淀粉酶（2 000 U/g），88～90 ℃保溫水解1 h。待溫度降至60 ℃時(shí)加入2%糖化酶（50 000 U/g）保溫糖化1 h，糖化結(jié)束后取1滴與碘液反應(yīng)，碘液不顯藍(lán)色即為反應(yīng)徹底。過濾，得濾液。將濾液冷藏過夜澄清，取上清液，調(diào)糖度為12°Bx，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-700高壓滅菌鍋：日本TOMY公司；MH400-S生化培養(yǎng)箱：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；DMI6000B熒光倒置顯微鏡：德國(guó)Leica公司；7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取頭：美國(guó)Agilent科技有限公司；UV-9000紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)：美國(guó)Biolog公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲菌懸液的制備

將大曲粉碎，過40目篩，稱取10 g曲樣加入90 mL無菌0.1%蛋白胨水溶液中，30 ℃、120 r/min振蕩30 min，靜置澄清，取上清液10倍逐級(jí)稀釋至適當(dāng)稀釋度，制備稀釋樣。

1.3.2 酵母菌的分離及純化

分別吸取稀釋梯度為10-3倍、10-4倍、10-5倍的稀釋液100 μL涂布于孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48～72 h。挑取生長(zhǎng)較好的、菌落形態(tài)不一的單菌落，接種于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，多次劃線分離，直至得到單菌落。對(duì)菌株的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，參照《常見與常用真菌》[18]對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.3.3 酵母菌的初篩

將分離獲得的酵母菌接種于YPD固體培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，在其上覆蓋一層TTC顯色劑[19]，于30 ℃恒溫培養(yǎng)3 h，取出，觀察顏色。初篩出顯色較深、生長(zhǎng)良好的菌株。

1.3.4 酵母菌發(fā)酵力測(cè)定

將分離得到的酵母菌劃線于YPD培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)劃線2次，將活化的酵母菌接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的試管中，裝液量10 mL，30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，獲得種子液。按1%（V/V）接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為100 mL/250 mL，28 ℃條件下培養(yǎng)72 h，采用發(fā)酵栓法[20]測(cè)定發(fā)酵力。

1.3.5 酵母菌產(chǎn)乙醇能力測(cè)定

將種子液按10%（V/V）的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為100 mL/250 mL，30 ℃條件下培養(yǎng)，分別在發(fā)酵3 d、5 d、7d時(shí)取樣，采用蒸餾法測(cè)定酒精度[21]。

1.3.6 酵母菌耐高溫特性測(cè)定

將種子液按10%（V/V）的接種量接種于YPD培養(yǎng)基，分別置于28 ℃、33 ℃、38 ℃、42 ℃和45 ℃條件下培養(yǎng)24 h，取樣，在波長(zhǎng)660 nm處測(cè)定吸光度值，以空白培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.3.7 酵母菌耐酒精能力測(cè)定

將種子液按10%（V/V）的接種量接種于酒精度分別為10%vol～17%vol的麥芽汁（糖度10 °Bx）中，放置杜氏小管，30 ℃培養(yǎng)。分別在發(fā)酵8 h、12 h、24 h時(shí)取樣，觀察產(chǎn)氣情況[22-23]。

1.3.8 酵母菌的鑒定

在無菌條件下，制備透光率為47%的菌懸液，將菌懸液接種于YT鑒定板上，每孔100 μL，26 ℃恒溫培養(yǎng)24 h、48 h后，采用Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定[24]。

1.3.9 菌種發(fā)酵產(chǎn)物GC-MS分析

將種子液按10%（V/V）的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為100 mL/250 mL，30 ℃條件下培養(yǎng)72 h。吸取50 mL發(fā)酵液，5 000 r/min離心10 min，取8 mL上清液，加入3.0 g氯化鈉，采用PDMS萃取頭頂空萃取30 min，采用GC-MS法[25]對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲中酵母菌的分離及形態(tài)觀察

根據(jù)菌株在培養(yǎng)基上的菌落特征，分離獲得9株菌株，命名為NDY-01～NDY-09，其菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1可知，9株菌株菌落形態(tài)均為乳白色，圓潤(rùn)，易挑起，顯微鏡觀察其細(xì)胞形態(tài)為橢圓狀，根據(jù)菌落和細(xì)胞形態(tài)初步鑒定9株菌株為酵母菌屬。

圖1 9株酵母菌的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Colony and cell morphology of 9 strains of yeast

2.2 大曲中功能酵母菌的篩選

2.2.1 TTC顯色結(jié)果

根據(jù)菌株產(chǎn)酒能力越強(qiáng)，顯色越明顯的原理[10，26]，從9株酵母菌中篩選得到3株使菌落呈深紫紅色的菌株，分別為菌株NDY-01、NDY-02、NDY-06。

2.2.2 酵母菌的發(fā)酵力

圖2 篩選菌株的發(fā)酵力Fig.2 Fermentation capacity of screened strains

9株菌株的發(fā)酵力測(cè)定結(jié)果見圖2。由圖2可知，9株酵母菌的發(fā)酵力為48.7～211.9g（CO2）/（100mL·72h），其中菌株NDY-06的發(fā)酵力最高，為211.9 g（CO2）/（100 mL·72 h）；菌株NDY-01和NDY-02次之，分別為206.3g（CO2）/（100 mL·72 h）、200.5 g（CO2）/（100 mL·72 h）；菌株NDY-04的發(fā)酵力最低，僅為48.7g（CO2）/（100mL·72h）。

2.2.3 酵母菌的產(chǎn)乙醇能力

選取發(fā)酵力較高的酵母菌NDY-01、NDY-02及NDY-06，測(cè)定其發(fā)酵3d、5d及7d的產(chǎn)乙醇能力，結(jié)果見表1。

表1 篩選菌株的產(chǎn)乙醇能力Table 1 Alcohol production ability of screened strains

由表1可知，菌株NDY-02的產(chǎn)乙醇能力最高，發(fā)酵7d時(shí)，餾出液的酒精度可達(dá)5.2%vol，菌株NDY-06次之（4.9%vol），菌株NDY-01最差（4.4%vol）。

2.2.4 酵母菌的耐高溫性能

對(duì)菌株NDY-01、NDY-02及NDY-06的耐高溫性能進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖3。

圖3 不同溫度下篩選菌株的生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth situation of screened strains at different temperatures

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，3株菌株的OD660nm值均逐漸降低，其中菌株NDY-06與NDY-02均可耐受42 ℃，且在42 ℃時(shí)，菌株NDY-06的OD660nm值＞菌株NDY-02，菌株的NDY-06的耐高溫性能最好，而菌株DNY-01可耐受38 ℃的溫度。

2.2.5 酵母菌的耐酒精能力

選取產(chǎn)乙醇能力較高且耐高溫性好的菌株NDY-06進(jìn)行耐酒精試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 篩選菌株的酒精耐受性Table 2 Alcohol tolerance of screened strains

由表2可知，當(dāng)酒精度＜16%vol時(shí)，酵母菌NDY-06均能產(chǎn)氣；當(dāng)酒精度為17%vol時(shí)，有微弱的產(chǎn)氣。因此，確定菌株NDY-06的耐酒精度為16%vol。

2.3 酵母菌NDY-06的鑒定

通過Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定酵母菌NDY-06為產(chǎn)香酵母Zygosaccharomyces cidri。

2.4 酵母菌NDY-06發(fā)酵產(chǎn)物GC-MS分析結(jié)果

采用HS-SPME-GC-MS方法對(duì)酵母菌NDY-06發(fā)酵液中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

表3 菌株NDY-06液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物GC-MS分析結(jié)果Table 3 Analysis results of liquid state fermentation products of strain NDY-06 by GC-MS

續(xù)表

由表3可知，通過GC-MS從菌株NDY-06液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中共檢測(cè)35種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中，醇類物質(zhì)7種，相對(duì)含量最大（75.97%），且乙醇相對(duì)含量最高，為33.24%，其次為3-甲基丁醇和苯乙醇，分別占23.89%和18.33%。3-甲基丁醇是一種高級(jí)醇，具有果香味[27]，苯乙醇具有玫瑰香，高級(jí)醇類是白酒中香氣與后味的過渡橋梁，起到調(diào)和作用[28]中重要的呈香物質(zhì)。酯類物質(zhì)13種，相對(duì)含量?jī)H次于醇類，為8.69%，包括辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、庚酸乙酯等酯類。在濃香型白酒的主體香味成分中，辛酸乙酯的絕對(duì)含量并不高，但其香氣強(qiáng)度貢獻(xiàn)值比傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為的四大乙酯中的乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯均要大，僅次于己酸乙酯，呈現(xiàn)較強(qiáng)的果香味[27，29]。酸類物質(zhì)共檢測(cè)出7種，其中包括辛酸、癸酸、己酸等，酸類化合物大多呈現(xiàn)酸味、奶酪香，是濃香型白酒中重要的一類風(fēng)味物質(zhì)[30]。此外，還檢測(cè)出3種吡嗪類物質(zhì)，不同類化合物間含量的比例對(duì)風(fēng)味品質(zhì)的影響也極其重要[31]，這些物質(zhì)共同構(gòu)成了該酵母的產(chǎn)香成分。

3 結(jié)論

本研究通過稀釋涂布平板法從濃香型大曲中共分離出9株酵母菌，通過TTC顯色法初篩，發(fā)酵力、產(chǎn)乙醇能力、高溫及酒精耐受性復(fù)篩篩選得到一株功能性酵母菌NDY-06，其可耐受42 ℃的高溫，16%vol的酒精度，且具有一定的發(fā)酵產(chǎn)酒能力；利用Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)鑒定其為一株產(chǎn)香酵母Zygosaccharomyces cidri；通過HS-SPME結(jié)合GC-MS從該菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中共檢測(cè)到35種揮發(fā)性物質(zhì)，包括醇類物質(zhì)7種，酯類物質(zhì)13種，酸類物質(zhì)7種，吡嗪類物質(zhì)3種，對(duì)白酒香氣成分有一定的貢獻(xiàn)。