李戀湘，肖奇志，王格，周玉球，李磊，胡玲玲

(珠海市婦幼保健院，珠海市醫(yī)學(xué)遺傳研究所，廣東 珠海 519001)

葉酸又稱蝶酰谷氨酸，是維生素B復(fù)合體之一，是人體尤其是孕婦必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。人體內(nèi)葉酸代謝有兩個(gè)限速酶，即亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和蛋氨酸合成酶還原酶(MTRR)。MTHFR將5，10-亞甲基四氫葉酸(5，10-MTHF)轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)，為體內(nèi)合成代謝提供了甲基；MTRR將5-MTHF進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為四氫葉酸(THF)，且將同型半胱氨酸(Hcy)轉(zhuǎn)化成蛋氨酸(Met)。故當(dāng)編碼這兩個(gè)酶的基因發(fā)生突變時(shí)，相應(yīng)酶活性就會(huì)降低，不能為體內(nèi)合成代謝提供足夠的5-MTHF，引起DNA、蛋白質(zhì)的合成與修飾反應(yīng)異常，染色體不穩(wěn)定，體內(nèi)Hcy蓄積，從而導(dǎo)致孕婦胚胎停止發(fā)育、習(xí)慣性流產(chǎn)、死胎，胎兒出現(xiàn)神經(jīng)管缺陷、先心病、唇腭裂等畸形或智障兒等不良孕產(chǎn)結(jié)局[1-2]。由于MTHFR和MTRR基因多態(tài)性直接影響葉酸代謝相關(guān)酶的活性，導(dǎo)致葉酸代謝障礙，檢測(cè)MTHFR和MTRR基因多態(tài)性可了解孕婦對(duì)葉酸的利用能力。目前，檢測(cè)MTHFR和MTRR基因多態(tài)性的方法很多，DNA測(cè)序仍為金標(biāo)準(zhǔn)，但因費(fèi)時(shí)價(jià)貴、分析通量小、設(shè)備及人員要求高等弊端，難以在臨床醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣使用。而熒光PCR探針熔解曲線分析(PMCA)技術(shù)則是一種用于已知基因突變檢測(cè)的技術(shù)，具有分析通量大、準(zhǔn)確快速和無(wú)需開蓋操作等優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于常見遺傳病(如地中海貧血和蠶豆病)基因診斷和產(chǎn)前診斷中[3-4]，市場(chǎng)應(yīng)用潛力巨大。本文應(yīng)用該技術(shù)檢測(cè)MTHFR C677T，MTHFR A1298C和MTRR A66G基因多態(tài)性并對(duì)孕婦群體葉酸利用能力進(jìn)行了遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，分析了其與血清Hcy的相關(guān)性。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2016年4月到珠海市婦幼保健院進(jìn)行產(chǎn)前保健的400 例孕婦，年齡18～43 歲，孕周為7～38+2周。

1.2 標(biāo)本采集

空腹8～12 h后采集靜脈血樣2支，每支2 mL，其中1支EDTA-K2抗凝管用于DNA分析，另1支干管收集的標(biāo)本待分離后用于檢測(cè)Hcy水平。測(cè)試前均與孕婦簽署了知情同意書。

1.3 試劑與儀器

全自動(dòng)核酸提取儀(廈門致善Lab-Aid824)；熒光PCR儀(上海宏石SLAN-96S)和全自動(dòng)生化分析儀(日立7180)。DNA抽提、MTHFR C677T及MTHFR A1298C和 MTRR A66G基因多態(tài)性熒光PCR探針熔解曲線試劑盒和血清Hcy檢測(cè)試劑盒分別由廈門致善生物科技有限公司[醫(yī)療器械注冊(cè)證號(hào)為：閩廈食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2014第1400001號(hào)]和廣州科方生物技術(shù)有限公司[醫(yī)療器械注冊(cè)證號(hào)為：粵食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2014第2400353號(hào)]提供。

1.4 方法

1.4.1 DNA抽提和質(zhì)量鑒定

1.4.2 基因多態(tài)性檢測(cè)

嚴(yán)格按照MTHFR C677T，MTHFR A1298C和MTRR A66G基因多態(tài)性熒光PCR探針熔解曲線檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作和結(jié)果判斷。簡(jiǎn)要過(guò)程如下：將適合的待測(cè)DNA樣本25 μL直接加到含PCR各種成分的0.2 mL擴(kuò)增反應(yīng)管中，短暫離心后轉(zhuǎn)至熒光PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熔解曲線分析。PCR循環(huán)參數(shù)為：預(yù)先50 ℃ 2 min去除擴(kuò)增產(chǎn)物污染后[尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)處理]，95 ℃預(yù)變性10 min后，接著進(jìn)行兩次PCR循環(huán)。第一次和第二次PCR循環(huán)參數(shù)分別為：95 ℃ 15 s→65 ℃ 15 s(每個(gè)循環(huán)下降1 ℃)→76 ℃ 20 s(10 cycles)和95 ℃ 1 min→55 ℃ 15 s→76 ℃ 20 s(50 cycles)。擴(kuò)增完畢后，即進(jìn)行熔解曲線分析。首先95 ℃變性1 min，45 ℃退火3 min，然后以0.4 ℃/s的速度從45 ℃升溫至85 ℃，同時(shí)采集熒光5-羧基熒光素(FAM)、6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯熒光素琥珀酰亞胺酯(HEX)、5-羧基-X-羅丹明琥珀酰亞胺酯(ROX)通道信號(hào)，從而可得到PCR產(chǎn)物熔解曲線。通過(guò)雙盲方式用DNA測(cè)序方法對(duì)受試個(gè)體的上述基因多態(tài)性進(jìn)行分析以驗(yàn)證該法的準(zhǔn)確度。DNA測(cè)序由廈門致善生物科技有限公司完成。

1.4.3 血清Hcy檢測(cè)

每批標(biāo)本均在室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)符合要求的前提下，采用酶循環(huán)法檢測(cè)血清Hcy水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 PMCA法的結(jié)果驗(yàn)證

通過(guò)雙盲方式，分別采用PMCA和DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了400份孕婦MTHFR C677T，MTHFR A1298C和MTRR A66G基因的多態(tài)性，兩者的結(jié)果完全吻合(有代表性的結(jié)果分別見圖1和圖2)。

a b c

a b c

2.2 基因的多態(tài)性和Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

PMCA檢測(cè)400 例珠海市孕婦MTHFR C677T，MTHFR A1298C和MTRR A66G基因多態(tài)性，其結(jié)果見表1。將MTHFR C677T，MTHFR A1298C和MTRR A66G基因分型經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，χ2值分別為1.315，0.163和1.501，P值分別為0.251，0.686和0.220，均大于0.05，說(shuō)明所檢孕婦具有區(qū)域代表性。MTHFR C677T位點(diǎn)TT，MTHFR A1298C位點(diǎn)CC，MTRR A66G位點(diǎn)GG純合子頻率分別為12.5%，1.7%和6.8%，MTRR A66G位點(diǎn)AG雜合子頻率為34.0%。

表1 珠海市孕婦常見葉酸代謝基因多態(tài)性分布及頻率

2.3 珠海市孕婦葉酸利用能力及血清Hcy水平

參照有關(guān)文獻(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)[5-6]，根據(jù)孕婦MTHFRC677T，MTHFR A1298C和MTRR A66G多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果，將孕婦個(gè)體葉酸利用能力遺傳風(fēng)險(xiǎn)依次從低到高分為未發(fā)現(xiàn)、低度、中度及高度風(fēng)險(xiǎn)四個(gè)等級(jí)，本組分別為181 例(45.25%)，21 例(5.25%)，141 例(35.25%)和57 例(14.25%)。各等級(jí)遺傳風(fēng)險(xiǎn)孕婦血清Hcy水平分別為(6.54±1.41)μmol/L，(6.80±1.23)μmol/L，(6.76±1.55)μmol/L和(7.71±1.94)μmol/L。Hcy水平升高(>11 μmol/L)者9 例，其中包括5 例高度、3 例中度和1 例未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)。高度風(fēng)險(xiǎn)組與未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)組血清Hcy水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.958，P<0.05)，中度風(fēng)險(xiǎn)組、低度風(fēng)險(xiǎn)組血清Hcy水平與未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.310和-0.826，P>0.05)。

3 討 論

在備孕和孕期添加葉酸有助于預(yù)防圍產(chǎn)兒出生缺陷。有報(bào)道[2]編碼葉酸代謝2個(gè)限速酶MTHFR和MTRR基因多態(tài)性-MTHFR C677T位點(diǎn)TT純合型及A1298C位點(diǎn)CC純合型、MTRR A66G位點(diǎn)GG純合型及AG雜合型均與不良孕產(chǎn)史密切相關(guān)。珠海市孕婦MTHFR C677T位點(diǎn)TT純合型基因頻率(12.5%)與廣東省內(nèi)深圳地區(qū)孕婦[5]、惠州漢族女性比較[6]差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.910和0.489，P>0.05)，MTHFR A1298C位點(diǎn)CC純合型基因頻率(1.7%)與兩地比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.846和13.723，P<0.05)，而MTRR A66G位點(diǎn)AG雜合型及GG純合型基因頻率(40.8%)與深圳地區(qū)孕婦[5]比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.787，P<0.05)，但與惠州漢族女性[6]比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.672，P>0.05)。本市與廣東周邊城市比較仍有其自身的分布特點(diǎn)。孕婦人群中葉酸利用能力遺傳高風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體比未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體發(fā)生不良孕產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)高2.61倍[7]，而且在孕期中長(zhǎng)期高Hcy水平也直接影響宮內(nèi)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致早產(chǎn)、低體重兒等出生[1-2]。本研究也發(fā)現(xiàn)孕婦葉酸利用能力遺傳高風(fēng)險(xiǎn)人群的血清Hcy水平明顯高于未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)人群(P<0.05)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)中低風(fēng)險(xiǎn)人群與未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)人群的血清Hcy水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，造成這種結(jié)果的主要原因是目前普遍提倡在備孕和孕期就補(bǔ)充足量的葉酸或富含葉酸的食物，從而使孕婦血清Hcy水平大多表現(xiàn)為正?；蛏卟幻黠@[8]。另外，MTRR基因多態(tài)性還可修正MTHFR C677T位點(diǎn)TT純合型對(duì)葉酸代謝的影響[9]。盡管如此，在不同遺傳風(fēng)險(xiǎn)組都能檢出血清Hcy水平明顯升高(高度、中度和未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)組分別為5 例、3 例、1 例)，所以，除了根據(jù)MTHFR和MTRR基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果給予個(gè)性化補(bǔ)充足量的葉酸外[10]，還可結(jié)合血清Hcy水平，采取有針對(duì)性的措施嚴(yán)密監(jiān)測(cè)胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育情況，以預(yù)防出生缺陷的發(fā)生。

目前臨床上檢測(cè)MTHFR和MTRR基因多態(tài)性大多采用DNA測(cè)序、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、Taqman-MGB以及質(zhì)譜等方法[1-2]，但大多操作繁瑣、昂貴費(fèi)時(shí)、分析通量小或設(shè)備要求高，不適宜于大規(guī)模推廣。PMCA技術(shù)是熒光PCR結(jié)合探針熔解曲線分析技術(shù)，PCR擴(kuò)增后通過(guò)檢測(cè)PCR產(chǎn)物多色熒光熔解曲線就可快速檢出一個(gè)或多個(gè)堿基的雜合或純合突變[3]，且檢測(cè)的DNA模板濃度范圍大(0.1～100 ng/μL)，而檢測(cè)時(shí)間僅需2.5 h，全程閉管操作，可防PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。由于熔解曲線熔點(diǎn)溫度值是由PCR儀自帶分析軟件自動(dòng)給出，結(jié)果判斷直觀。作者通過(guò)雙盲方式，同時(shí)采用PMCA和DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了400 例珠海孕婦MTHFR和MTRR基因3個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性，結(jié)果兩者完全吻合，說(shuō)明該技術(shù)準(zhǔn)確可靠。PMCA方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確靈敏、快速經(jīng)濟(jì)、檢測(cè)通量高且針對(duì)性強(qiáng)，非常適合于大規(guī)模用于臨床一線孕婦MTHFR和MTRR基因多態(tài)性的檢測(cè)。

MTHFR和MTRR基因多態(tài)性與葉酸代謝的關(guān)系引起了臨床的高度關(guān)注，并正成為備孕和孕期精確補(bǔ)充葉酸的靶點(diǎn)。PMCA方法是一項(xiàng)適合于臨床一線檢測(cè)MTHFR和MTRR基因多態(tài)性的實(shí)用技術(shù)。而MTHFR和MTRR基因多態(tài)性檢測(cè)對(duì)于臨床評(píng)估孕婦葉酸利用能力的遺傳風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)高危孕婦個(gè)性化補(bǔ)充葉酸和防止不良孕產(chǎn)結(jié)局有著重要的臨床實(shí)用價(jià)值。但PMCA技術(shù)也有自身的不足，如只能檢測(cè)到探針覆蓋區(qū)域的序列變異，對(duì)設(shè)備及DNA的要求高，且還可能存在引物非特異性擴(kuò)增、要求PCR產(chǎn)物片段在一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)等[11]。它雖可同時(shí)檢測(cè)到未知基因多態(tài)性位點(diǎn)，但需采用DNA測(cè)序或其他方法做進(jìn)一步的驗(yàn)證。另外，MTHFR和MTRR基因多態(tài)性檢測(cè)若用于產(chǎn)前診斷，需提前了解胎兒營(yíng)養(yǎng)狀況，還有待臨床進(jìn)一步研究。