劉娜,陳颯
(陜西中檢計量測試技術(shù)有限公司,西安 710068)
砷廣泛存在于地殼、土壤、海水、河水、大氣及食物中,極少以單質(zhì)狀態(tài)存在,幾乎所有物質(zhì)中都含有砷。砷是類金屬元素,它的毒性及某些性質(zhì)與重金屬相似,所以也被列入重金屬污染物范圍內(nèi)。砷的毒性與它的化學(xué)性質(zhì)與離子存在價態(tài)有關(guān)。不同形態(tài)的砷化合物,其毒性差別較大,單質(zhì)砷不溶于水,因此人體攝入后幾乎不被吸收,完全排出,通常無害;有機(jī)砷,除砷化氫衍生物外,一般毒性較弱;無機(jī)砷中三價砷對細(xì)胞毒性最強(qiáng),如As2O3,AsCb,H3AsO3,AsH3等化合物,均具有劇烈毒性;五價砷毒性較弱,在人體內(nèi)被還原轉(zhuǎn)化為三價砷后,才能發(fā)揮其毒性作用。人體和動物實驗表明,無機(jī)砷化物容易被人體吸收。除了大量攝入時的急性中毒外,長期少量地攝入砷也會有致癌的風(fēng)險[1-2]。2017年10 月27 日,世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單,砷和無機(jī)砷化合物列為一類致癌 物[3]。水生生物由于其生活習(xí)性易于富集高濃度的砷,從而導(dǎo)致水產(chǎn)品品質(zhì)受到影響。因此更受到大家的關(guān)注[4-7]。
隨著我國監(jiān)管控制逐漸規(guī)范化,GB2762-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》[8]對水產(chǎn)品中無機(jī)砷提出了明確的限量要求,規(guī)定水產(chǎn)品(魚類除外)中無機(jī)砷限量為0.5 mg/kg。因此檢測水產(chǎn)品中無機(jī)砷的含量具有重要的意義和作用。
目前無機(jī)砷的測定方法主要有兩種,一種是采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ICP-MS),通過液相色譜柱對樣品中多種形態(tài)的砷進(jìn)行分離,利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀進(jìn)行分析測定,此方法操作簡便,結(jié)果穩(wěn)定,但電感耦合等離子體質(zhì)譜儀價格高昂,運(yùn)行成本也相對較高,而且此方法檢測限量較之原子熒光光譜法略差;另一種是采用高效液相色譜-原子熒光光譜儀聯(lián)用技術(shù)(HPLC-AFS),前處理方式相同,利用原子熒光光譜儀進(jìn)行分析測定。原子熒光光譜儀均為國內(nèi)生產(chǎn),價格相對便宜,普通檢測實驗室均有配置,且此類設(shè)備靈敏度極佳,檢出限優(yōu)于HPLC-ICP-MS一個數(shù)量級之多。缺點是有時儀器運(yùn)行不夠穩(wěn)定,平行性不夠[9-10]。
我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn),GB 5009.11-2014 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無機(jī)砷的測定》[11]中,對兩種方法均允許使用。筆者依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)使用液相色譜聯(lián)用原子熒光光譜儀平行檢測了水產(chǎn)品中無機(jī)砷的含量,對整個測量過程中所有不確定度的來源進(jìn)行了分析,對各個不確定的分量進(jìn)行了評估和合成[12-13],明確了測定結(jié)果不確定度和主要來源,對提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度具有一定意義。
原子熒光形態(tài)分析儀:SA50 型,配備有液相色譜部分和原子熒光反應(yīng)與檢測部分,北京吉天儀器有限公司;
色譜柱:PRP-X100 型,250 mm×4 mm,美國安捷倫科技有限公司;
電子天平:BSA224S 型,感量為0.000 1 g,德國賽多利斯公司;
離心機(jī):Sigma 3 K15 型,德國西格瑪公司;
pH 計:STARTER 3100 型,美國奧豪斯公司;
烘箱:Venticell 11 型,德國MMM 公司;
有機(jī)濾膜:孔徑為0.45 μm,上海安譜實驗科技股份有限公司;
C18小柱:BOND Elut C18型,500 mg,6 mL,美國安捷倫科技有限公司;
磷酸二氫氨、氫氧化鉀、氨水:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;
硝酸、鹽酸:光譜純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限 公司;
正己烷:色譜純,美國Fisher 公司;
三價砷標(biāo)準(zhǔn)溶液:編號為TPIV-CGAS(3)1-1,1 000 μg/mL,美國inorganic 公司;
五價砷標(biāo)準(zhǔn)溶液:編號為TPIV-CGAS(5)1-1,1 000 μg/mL,美國inorganic 公司。
依據(jù)GB 5009.11-2014 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總砷及無機(jī)砷的測定》,使用液相色譜聯(lián)用原子熒光光譜儀平行檢測水產(chǎn)品中無機(jī)砷的含量。
稱取1.0 g 經(jīng)食品勻漿機(jī)粉碎均勻的海螃蟹樣品,置于50 mL 塑料離心管中,加入0.15 mol/L 的稀硝酸20 mL,封口,預(yù)消解過夜(約15 h)。將樣品置于90℃烘箱中熱浸提2.5 h,每半小時振搖1 min。冷卻至室溫,置于離心機(jī)中以8 000 r/min 離心15 min。取上清液5 mL,加入5 mL 正己烷,振搖1 min,置于離心機(jī)中以8 000 r/min 離心15 min,棄上層正己烷,再加5 mL 正己烷重復(fù)萃取一次。取下層清液,過孔徑為0.45 μm 的有機(jī)濾膜,用C18小柱凈化后上機(jī)進(jìn)行測定。
在生物體內(nèi)和樣品前處理過程中,三價砷與五價砷可以相互轉(zhuǎn)化,三價砷相對比較穩(wěn)定,按照標(biāo)準(zhǔn)方法,如單獨測定三價砷或五價砷,結(jié)果平行性并不好,回收率時高時低,大多數(shù)情況下,三價砷回收率偏高而五價砷回收率偏低,但總無機(jī)砷含量基本恒定[2],因此檢測標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定是以三價砷與五價砷加和總量計算,即討論無機(jī)砷總量的 檢測。
三價砷與五價砷均采用外標(biāo)法定量,按式(1)
計算含量:
式中:X——樣品中無機(jī)砷含量,mg/kg;
c——測定溶液中無機(jī)砷濃度,μg/L;
c0——空白溶液中無機(jī)砷濃度,μg/L;
V——試樣消解液總體積,mL;
m——試樣質(zhì)量,g;
1 000——換算系數(shù)。
總無機(jī)砷含量等于三價砷含量與五價砷含量之和。計算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。
無機(jī)砷含量測定結(jié)果不確定度的來源主要有以下幾個方面:
(1)重復(fù)性實驗導(dǎo)致的不確定度。包括樣品均勻性、天平稱重重復(fù)性、體積重復(fù)性和回收率重 復(fù)性。
(2)樣品溶液制備過程引入的不確定度。包括試樣質(zhì)量和浸提萃取引入的不確定度。
(3)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度。包括標(biāo)準(zhǔn)儲備液的不確定度和稀釋所引入的不確定度。
(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度。
具體來源詳見圖1。
圖1 不確定度主要來源圖
依據(jù)GB 5009.11-2014 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總砷及無機(jī)砷的測定》檢測6 個平行樣品,同時測定空白。平行檢測2 個空白得到空白結(jié)果均為0,故測得值即為檢測值,計算結(jié)果列于表1。
表1 無機(jī)砷平行測定結(jié)果
無機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)偏差s=0.001 1 mg/kg,平行測定次數(shù)n=6,則A 類不確定度:
A 類相對不確定度:
2.3.1 樣品溶液制備過程引入的不確定度urel(pre)
(1)樣品稱量引入的不確定度urel(m)。稱量使用萬分之一天平,按均勻分布計算,不確定度u(m)=0.1/ 3 =0.058 mg,稱樣量平均為1 g,則樣品稱量引入的不確定度urel(m)=0.058/1 000=0.000 06。
(2)浸提萃取時引入的不確定度。所使用20 mL 單標(biāo)移液管(A 級)的校準(zhǔn)證書中給出不確定度為0.02 mL,則帶來的不確定度urel(V20)=0.02/20=0.001。
2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制產(chǎn)生的不確定度urel(C)
(1)三價砷標(biāo)準(zhǔn)儲備液。濃度為1 000 μg/mL,證書給出的擴(kuò)展不確定度為4 μg/mL,則標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(CAs3+)=4/2=2 (μg/mL),相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(CAs3+)=2/1 000=0.002。
(2)五價砷標(biāo)準(zhǔn)儲備液。濃度為1 000 μg/mL,證書給出的擴(kuò)展不確定度為4 μg/mL,則標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(CAs5+)=4/2=2 (μg/mL),相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(CAs5+)=2/1 000=0.002。
(3)移液器引入的不確定度。使用100 μL 可調(diào)移液器,校準(zhǔn)證書給出不確定度為0.9 μL,則標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V100)=0.9/100=0.009。
將上述不相關(guān)分量不確定度進(jìn)行合成,得到標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度:
(1)三價砷標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(C1)。采用5 個不同濃度的三價砷標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定得到相應(yīng)的光譜強(qiáng)度值yi,測量數(shù)據(jù)見表2。對其進(jìn)行一元線性擬合,得到直線方程。
表2 三價砷標(biāo)準(zhǔn)曲線測定數(shù)據(jù)
其中,S(y)=3 574.49,則u(C1)=0.490 01。
三價砷(As3+)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C1)=u(C1)/C1=0.086。
(2)五價砷標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(C2)。采用5 個不同濃度的五價砷標(biāo)準(zhǔn)溶液,得到相應(yīng)的光譜強(qiáng)度值yi,測量數(shù)據(jù)見表3。對其進(jìn)行一元線性擬合,得到直線方程。
表3 五價砷標(biāo)準(zhǔn)曲線測定數(shù)據(jù)和計算結(jié)果
擬合得到校正標(biāo)準(zhǔn)曲線y=5 817.3x+3 345.9,則截距a=3 345.9,斜率b=5 817.3,R2=0.9 995。對試樣測定6 次,五價砷的平均濃度C2=4.1 μg/L,則n=6,標(biāo)準(zhǔn)曲線5 個點,重復(fù)測3 次,P=15,則五價砷標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式(1)計算,其中,S(y)=8 889.37,則u(C2)=0.657 27。
五價砷(As5+)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C2)=u(C2)/C2=0.160 3。
將上述各不相關(guān)不確定度分量進(jìn)行合成,得到合成不確定度:
u(X)=X·urel(X)=0.196×0.182 2=0.035 7 (mg/kg)。
水產(chǎn)品中無機(jī)砷含量的擴(kuò)展不確定度,取包含因子k=2,擴(kuò)展不確定度:
U(X)=2×u(X)≈0.071 mg/kg。
液相色譜-串聯(lián)原子熒光光譜法測定水產(chǎn)品中無機(jī)砷的不確定度來源為重復(fù)性實驗導(dǎo)致的不確定度;樣品溶液制備過程引入的不確定度;標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度;標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度。由不確定度各分量的評估結(jié)果可看出,實驗的各個因素均可對不確定度貢獻(xiàn),其中標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度為主要分量,增加標(biāo)曲點數(shù)可以降低該不確定度分量。研究著眼于標(biāo)準(zhǔn)方法的實際應(yīng)用,對不同儀器和分析對象也具有參考意義。