李靜靜，范菲，朱清

（西安市食品藥品檢驗所，西安 710054）

水楊酸最早是從柳樹皮中分離出的一種活性成分，后被證實是植物體內(nèi)廣泛存在的一種天然酚類化合物，對一些重要的代謝過程起調(diào)控作用，所以被看作為一種植物激素［1］。水楊酸除具有防腐殺菌作用外，還有止痛消炎，角質(zhì)剝脫，促進皮膚新陳代謝的功能，被廣泛應用于化妝品行業(yè)，存在于各種去屑、美白和祛痘類化妝品中［2-3］。但水楊酸的角質(zhì)層剝脫功能在去角質(zhì)同時也具有腐蝕作用，易刺激皮膚、黏膜，過量使用會使皮膚的防御力變差［4-5］。因此不適宜長期使用，尤其不適用于兒童。

《化妝品安全技術規(guī)范》（2015 年版）［6］中采用高效液相色譜法對化妝品中的水楊酸進行測定，并且明確規(guī)定了水楊酸在駐留類產(chǎn)品和淋洗類皮膚用產(chǎn)品中最大許可用量為2.0%，在淋洗類發(fā)用產(chǎn)品中最大許可用量為3.0%，但是在化妝品中作為防腐劑使用時，最大許可用量為0.5%，并注明除香波外，不得用于三歲以下兒童使用的產(chǎn)品中?！痘瘖y品安全技術規(guī)范》（2015 版）對水楊酸的限量要求與舊版（2007 版）相同，但不同于舊版中將水楊酸作為去屑劑組分和其它組份共同測定。2015 年版首次增加了單獨針對化妝品中水楊酸含量的專屬檢測方法，反映了我國對于化妝品質(zhì)量安全性保障、技術標準的專屬性和可操作性等在進一步提高，加強了市場監(jiān)管力度。

測量不確定度是對測量結(jié)果準確度的定量表征，測量結(jié)果的可用性很大程度上取決于不確定度的大?。?］?？紤]到測量過程中影響因素復雜，測定結(jié)果必然會帶有一定的不確定性，會導致評判依據(jù)可信度降低。所以測量結(jié)果附有不確定度說明才是完整并有意義的。近年來，各類檢驗檢測機構(gòu)都開展了大量的不確定度評定工作［8-12］，以此提升實驗結(jié)果的可信度和可用性。筆者參照《化妝品安全技術規(guī)范》（2015 年版），用高效液相色譜法對化妝品中水楊酸的含量進行了測定，根據(jù)新版JJF 1059.1—2012 《測量不確定度評定與表示》［13］，建立數(shù)學模型，對這一實驗過程的各項影響因素進行了不確定度評估，為評定測量結(jié)果提供科學依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：ULTIMATE 3000 型，配DAD 檢測器，美國賽默飛世爾科技有限公司；

電子天平：MS105 型，d=0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司；

電子天平：BSA124S-CW，感量為0.1 mg，德國賽多利斯公司；

水楊酸標準品：99.9%，中國藥品生物制品檢定所；

甲醇、磷酸、氨水：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

磷酸溶液：稱取11.5 g 磷酸，加入950 mL 水，用氨水調(diào)節(jié)至pH2.3～2.5，加水至1 000 mL；

實驗用具為計量檢定合格的A 級玻璃量器；

實驗用水為Milli-Q 自制超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：C8（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本SHISEIDO CAPCELL PAK）；檢測波長：300 nm；柱溫：30℃；流動相A：量取200 mL 磷酸溶液，并用水稀釋至1 000 mL；流動相B：量取250 mL 磷酸溶液，并用甲醇稀釋至1 000 mL；流量1.2 mL／min；梯度洗脫程序見表1。

1.3 實驗環(huán)境條件

溫度為(20±5)℃，相對濕度不大于75%。

表1 梯度洗脫程序

1.4 水楊酸系列標準溶液的制備

稱取水楊酸對照品50 mg 置于50 mL 容量瓶，用甲醇溶解并定容，作為標準儲備液。再分別精密量取1，2，5，10，20 mL 標準儲備液，置于100 mL 量瓶中，用甲醇定容后作為水楊酸系列標準溶液。

1.5 樣品處理

稱取樣品約0.25 g，置25 mL 具塞比色管中，加入甲醇20 mL，旋渦60 s，分散均勻，超聲提取15 min，冷卻至室溫后，用甲醇定容至標線，渦旋振蕩搖勻后，用0.45 μm 有機濾膜過濾后，作為待測溶液。

2 數(shù)學模型及測量不確定度的來源

2.1 數(shù)學模型

樣品中水楊酸含量按照式(1)計算：

式中：w——化妝品中水楊酸的質(zhì)量分數(shù)，%；

D——稀釋倍數(shù)（不稀釋則為1）；

ρ——從標準曲線得到的水楊酸質(zhì)量濃度，μg／mL；

V——樣品定容體積，mL；

m——樣品取樣量，g。

樣品測定結(jié)果的不確定度除上述計算公式中的ρ，V和m的影響外，重復測定樣品時的均勻性和一致性也會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。

2.2 測量不確定度的來源

由式(1)分析，不確定度的來源如下。

（1）標準物質(zhì)引入的不確定度：包括標準物質(zhì)純度u(w)、標準物質(zhì)稱重u(m1)、玻璃量瓶u(V1)、玻璃移液管u(V2)、由標準曲線引入的不確定 度u(C)；

（2）被測樣品引入的不確定度：包括樣品稱重u(m2)、定容u(V3)、樣品平行測定重復性引入的不確定度u(f)；

（3）測量時液相色譜儀引入的不確定度u(r)。

式(1)中各分量相互獨立，合成相對標準不確定度按照式(2)計算。

3 測量不確定度評定

3.1 標準物質(zhì)引入的相對標準不確定度

3.1.1 純度引入的相對標準不確定度urel(w)

水楊酸標準物質(zhì)說明書標識其純度為99.9%，但未給出其純度誤差范圍，假定其分布區(qū)間為±0.1%，其區(qū)間半寬度為0.1%，按均勻分布（矩形分布）考慮，包含因子3k=，則標準物質(zhì)純度引入的相對標準不確定度：

3.1.2 天平稱重引入的相對標準不確定度urel(m1)

標準物質(zhì)稱量所用天平的精度為十萬分之一，其不確定度來源主要考慮兩項：示值誤差u(m1a)、重復性誤差u(m1b)。

校準證書給出的重復性誤差為0.15 mg，其區(qū)間半峰寬為0.075 mg，按矩形分布計算（3k=），則重復性引入的不確定度：

由以上兩項合成得到標準不確定度：

實際稱取水楊酸標準物質(zhì)為49.94 mg，其純度為99.9%，則天平稱量引入的相對標準不確定度：

3.1.3 容量瓶引入的相對標準不確定度urel(V1)

容量瓶引入的不確定度分量包括容量允差u(V1a)，和實驗溫度與校正溫度差異引入的不確定度u(V1b)。

容量允差引入的相對標準不確定度：

（2）溫度校正引入的不確定度u(V1b)。已知實驗環(huán)境溫度為25℃，容量瓶校準溫度為20℃，甲醇和玻璃的膨脹系數(shù)分別為1.2×10-3，2.5×10-4℃-1，按照均勻分布，包含因子3k=，溫度差異引入的不確定度：

u(V1b-1)=(1.2×10-3-2.5×10-4)×50×(25-20)／k=0.14 (mL)

u(V1b-2)=(1.2×10-3-2.5×10-4)×100×(25-20)／k=0.27 (mL)

溫度校正引入的相對標準不確定度：

容量瓶引入的相對標準不確定度：

3.1.4 移液管引入的相對標準不確定度urel(V2)

同理，移液管引入的不確定度分量包括容量允差、實驗溫度與校正溫度差異帶來的影響，數(shù)據(jù)列于表2。

表2 移液管引入的不確定度

移液管引入的相對標準不確定度：

3.1.5 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(C)

采用最小二乘法，以濃度C為橫坐標，平均峰面積A為縱坐標，進行線性擬合，結(jié)果列于表3。

表3 水楊酸標準溶液校準結(jié)果

由表3 得到標準曲線為A=26.126 6C+5.385 5，其中，相關系數(shù)r2=1.000 0，斜率a=26.126 6，截距b=5.385 5。

按照式(3)計算標準溶液峰面積的標準偏差：

式中：n——標準溶液測定次數(shù)，n=10；

a——線性回歸方程斜率；

b——線性回歸方程截距。

將上述各值代入式(3)，計算得s(A)=5.701 1。

按照式(4)計算由工作曲線變動引起濃度C的標準不確定度u(C)：

式中：s(A)——標準溶液峰面積的標準偏差：

N——樣品平行測定次數(shù)，N=4；

C——被測樣品溶液中水楊酸的質(zhì)量濃度，18.73 μg／mL；

C——標準系列溶液的平均質(zhì)量濃度，75.83 μg／mL；

將上述各值代入式(4)，計算得u(C)=0.152 1，則標準曲線引入的相對標準不確定度：

3.2 被測樣品引入的相對標準不確定度

3.2.1 樣品稱重引入的相對標準不確定度urel(m2)

合成得樣品稱量引入的標準不確定度：

已知樣品稱取兩份，分別為0.261 3 g，0.265 0 g，則樣品稱量引入的相對標準不確定度：

3.2.2 比色管引入的相對標準不確定度urel(V3)

（2）溫度校正引入的不確定度。已知實驗環(huán)境溫度為25℃，比色管校準溫度為20℃，甲醇和玻璃的膨脹系數(shù)分別為1.2×10-3和2.5×10-4℃-1，按照矩形分布（3k=），溫度校正引入的不確定度：

u(V3b)=(1.2×10-3-2.5×10-4)×10×(25-20)／k=0.027 (mL)

比色管引入的相對標準不確定度：

3.2.3 重復性測定引入的相對標準不確定度urel(f)

該不確定度為A 類評定，在實際測量樣品時，對2 份樣品各測定2 次（n=4），含量分別為18.44，18.50，18.98，18.99 μg／mL，實際測量中以平均值18.73 μg／mL 作為測量結(jié)果。

重復性測定引入的相對標準不確定度為：

3.3 液相色譜儀引入的相對標準不確定度urel(r)

由校準證書上可知，高效液相色譜儀的定量重復性為0.21%，則其相對擴展不確定度為0.21%。按分布計算，包含因子3k=，則液相色譜儀引入的的相對標準不確定度：

3.4 相對合成標準不確定度

測量不確定度各分量的分析結(jié)果見表4。

表4 各分量相對標準不確定度匯總

根據(jù)式(2)計算合成相對標準不確定度：

3.5 相對標準擴展不確定度

根據(jù)公式(1)和兩次獨立測定結(jié)果計算得到2 份化妝品樣品中水楊酸的含量為0.177%和0.179%，平均值為0.178%。因此其平均含量的相對標準不確定度：

取置信概率為95%，包含因子k=2。則相對標準擴展不確定度：

3.6 標準擴展不確定度

化妝品中水楊酸含量的標準擴展不確定度為：

3.7 不確定度報告

化妝品中水楊酸含量為0.178%±0.004%，k=2。

4 結(jié)語

高效液相色譜法測定水楊酸含量不確定度的主要影響來源于標準曲線擬合、樣品重復測定、玻璃量器的使用，以及樣品和標準品稱重等。工作曲線各校準點濃度均值應盡量與被測樣品濃度均值C接近，可降低標準曲線變動引入的不確定度。在稱量樣品時，兩份樣品的稱量值應當盡量接近，可降低樣品重復測定引入的不確定度。在使用玻璃量器時，盡量使用校正級別高的量器，并且控制實驗室溫度與量器校準時溫度接近，可降低玻璃量器引入的不確定度。在樣品和標準品稱重時，在可操作范圍內(nèi)盡量加大取樣量，可降低由稱重引入的不確定度。