汪海宣，桑曉斌，許倩

（1.合肥市食品藥品檢驗(yàn)中心，合肥 230051； 2.安徽省先鋒制藥有限公司，合肥 230001）

更昔洛韋是繼阿昔洛韋之后開發(fā)的一種新型核苷酸嘌呤類抗病毒藥，由英國(guó)Syntex 公司研制并于1988 年上市［1］，是首個(gè)用于治療人體巨細(xì)胞病毒感染的有效抗病毒藥［2］，其臨床應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，如外用更昔洛韋預(yù)防內(nèi)皮角膜移植術(shù)后巨細(xì)胞病毒內(nèi)皮炎［3］，臨床使用更昔洛韋的多種治療方案治療腸道巨細(xì)胞病毒性結(jié)腸炎［4］，腺病毒介導(dǎo)的單純皰疹病毒胸苷激酶聯(lián)合更昔洛韋對(duì)肝細(xì)胞癌有一定的治療作用［5］等。藥品中雜質(zhì)含量直接影響藥物質(zhì)量和療效，因此需要對(duì)更昔洛韋雜質(zhì)進(jìn)行分析，以更好的控制藥物質(zhì)量，減少或降低藥物的不良反應(yīng)。

參照國(guó)外相關(guān)藥品法典［6-8］對(duì)更昔洛韋中可能含有的6 種已知雜質(zhì)進(jìn)行研究，分別為2-氨基-9-［［（2-氯丙基-2-烯-1-基）氧］甲基］-1，9-二氫-6H-嘌呤-6-酮（雜質(zhì)A）、（2RS）-2［（2-氨基-6-氧代-1，6-二氫-9H-嘌呤-9-基）甲氧基］-3-羥丙基丙酸酯（簡(jiǎn)稱雜質(zhì)B）、2-氨基-9-［［（1Rs）-2-氯-1-（羥甲基）乙氧基］甲基］-1，9-二氫-6H-嘌呤-6-酮（簡(jiǎn)稱雜質(zhì)C）、2-氨基-9-［［［2-羥基-1-（羥甲基）乙氧基］甲氧基］甲基］-1，9-二氫-6H-嘌呤-6-酮（簡(jiǎn)稱雜質(zhì)D）、2-氨基-9-［［（2Rs）-2-3-二羥基丙氧基］甲基］-1，9-二氫-6H-嘌呤-6-酮（簡(jiǎn)稱雜質(zhì)E）和2-氨基-1，9-二氫-6H-嘌呤-6-酮（簡(jiǎn)稱雜質(zhì)F）。雜質(zhì)可能由更昔洛韋原料合成工藝引入［9-12］，雜質(zhì)A、雜質(zhì)C 和雜質(zhì)E 為起始物料側(cè)鏈，雜質(zhì)B 和雜質(zhì)F 為合成副產(chǎn)物。

目前國(guó)內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)采用高效液相色譜法檢測(cè)更昔洛韋含量及有關(guān)物質(zhì)，用主成分自身對(duì)照法計(jì)算其總雜質(zhì)的相對(duì)含量［13］，無(wú)法反映出其特定雜質(zhì)的具體含量。筆者參照國(guó)外相關(guān)藥典［6-8］和文獻(xiàn)資料［14-17］，建立高效液相色譜法對(duì)注射用更昔洛韋和原料中可能含有的6 種已知特定雜質(zhì)進(jìn)行研究，分別測(cè)定各特定雜質(zhì)的含量。由于雜質(zhì)D 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定等因素，單體較難獲得，國(guó)內(nèi)外均無(wú)法單獨(dú)提供該單體對(duì)照品，采購(gòu)歐盟對(duì)照品系雜質(zhì)A，B，C，D，E，F(xiàn) 混合物，無(wú)準(zhǔn)確雜質(zhì)D 含量及濃度，筆者采用該混合物對(duì)照品對(duì)雜質(zhì)D 進(jìn)行定位及確認(rèn)相對(duì)保留時(shí)間，采用面積歸一化法對(duì)其含量進(jìn)行考察。該方法簡(jiǎn)單快捷，專屬性強(qiáng)，精密度好，可用于更昔洛韋中雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E 和雜質(zhì)F 的檢查分析，為更好地控制更昔洛韋原料及制劑的質(zhì)量提供了參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

電子天平：XP-205 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司；

高效液相色譜儀：LC-20A 型，配備SPD-20A二極管陣列檢測(cè)器（DAD），日本島津公司；

多功能參數(shù)測(cè)量?jī)x：Sevenmullti 型，瑞士梅特勒-托利多公司；

恒溫恒濕培養(yǎng)箱：BSC-150 型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

更昔洛韋原料：藥用，批號(hào)為2017-1S，2017-2 s，上藥康麗（常州）藥業(yè)有限公司；

注射用更昔洛韋：批號(hào)為2017-1t，2017-2t，2017-3t，自制；

更昔洛韋對(duì)照品：批號(hào)為100380-201103，中國(guó)食品藥品檢定研究院；

更昔洛韋雜質(zhì)A，B，C，E 對(duì)照品：批號(hào)分別為1840-086A1，1563-053A8，2466-039A1，1863-093A2，加拿大梯爾希公司；

更昔洛韋雜質(zhì)F 對(duì)照品：批號(hào)為R018Q0，美國(guó)藥典委員會(huì)；

更昔洛韋雜質(zhì)混合物對(duì)照品：包含雜質(zhì)A，B，C，D，E 和F，批號(hào)為002472，歐洲藥品質(zhì)量和保健理事會(huì)；

乙腈、三氟乙酸：色譜純，美國(guó)賽默飛公司；

氫氧化鈉、鹽酸、過氧化氫：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：USP L9 SCX 柱（250 mm×4.6 mm，10 μm，英國(guó)沃特曼公司），以強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換基團(tuán)鍵合硅膠為填充劑；流量：1.5 mL／min；流動(dòng)相：0.05%三氟乙酸溶液-乙腈（50∶50）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.3 溶液的配制

供試品溶液：精密稱取更昔洛韋原料和注射用更昔洛韋內(nèi)容物適量，分別用流動(dòng)相溶解并制成約含0.6 mg／mL 更昔洛韋的溶液。

更昔洛韋對(duì)照品溶液：精密稱取更昔洛韋對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解并制成約含0.6 mg／mL 更昔洛韋的溶液。

對(duì)照溶液：精密量取1 mL 供試品溶液，置于100 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至標(biāo)線，搖勻，再精密量取5 mL，用流動(dòng)相稀釋定容至50 mL，搖勻。

陰性樣品溶液：取制劑的除主成分外輔料配制相同濃度溶液。

更昔洛韋系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密移取更昔洛韋對(duì)照品溶液1 mL 至100 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻，再分別精密吸取0.5，1，1，3，2，2 mL，依次置入20，20，10，20，10，5 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻，研制成更昔洛韋的質(zhì)量濃度分別為15，30，60，90，120，240 μg／mL 的更昔洛韋系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

雜質(zhì)儲(chǔ)備溶液：精密稱取雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E 和雜質(zhì)F 對(duì)照品適量，分別置于5 個(gè)棕色量瓶中，雜質(zhì)F 中加入0.2 mol／L 的NaOH 溶液3 mL，分別用流動(dòng)相溶解并稀釋定容至標(biāo)線，搖勻，制成雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F 質(zhì)量濃度分別約為90，120，90，90，240 μg／mL 的雜質(zhì)儲(chǔ)備溶液。

系統(tǒng)適用性溶液：取一支更昔洛韋雜質(zhì)混合物對(duì)照品（含雜質(zhì)A，B，C，D，E 和F），用1 mL 上述更昔洛韋對(duì)照品溶液溶解。

雜質(zhì)定位溶液：分別精密移取雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F 對(duì)照儲(chǔ)備溶液各1 mL，置于5 只100 mL 容量瓶中，依次用流動(dòng)相定容至標(biāo)線，搖勻，制成雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F 的質(zhì)量濃度均分別為為0.9，1.2，0.9，0.9，2.4 μg／mL的雜質(zhì)定值溶液。

雜質(zhì)混合儲(chǔ)備溶液：分別精密移取雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F 雜質(zhì)儲(chǔ)備溶液各5 mL，置于同一50 mL 棕色量瓶中，加流動(dòng)相稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻，制成雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F 的質(zhì)量濃度分別約為9，12，9，9，24 μg／mL 的雜質(zhì)混合儲(chǔ)備溶液。

系列混合雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精密吸取雜質(zhì)混合儲(chǔ)備溶液0.5，1，1，3，2，2 mL，依次置于20，20，10，20，10，5 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

參照國(guó)內(nèi)外相關(guān)藥品法典［6-8］和相關(guān)文獻(xiàn)資 料［9］，對(duì)供試品溶液和系統(tǒng)適用性溶液經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器在200～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描，更昔洛韋和各雜質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)均在（254±2） nm內(nèi)，故選擇254 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)，經(jīng)試驗(yàn)研究表明，各雜質(zhì)峰的峰純度均大于0.999。

2.2 色譜條件的選擇

參照國(guó)內(nèi)外相關(guān)藥品法典［6-9］以及文獻(xiàn)資 料［2，10-14］，對(duì)不同填料的色譜柱包括十八烷基鍵合硅膠柱，氰基鍵合硅膠柱，氫型陽(yáng)離子交換鍵合硅膠柱，磺酸基陽(yáng)離子交換鍵合硅膠柱；流動(dòng)相包括0.05%三氟乙酸-乙腈（50∶50），0.25%磷酸二氫鉀溶液-甲醇（9∶1）；柱溫包括30，35，40℃分別進(jìn)行考察實(shí)驗(yàn)，最終選擇磺酸基陽(yáng)離子交換鍵合硅膠柱，0.05%三氟乙酸-乙腈（50∶50）為流動(dòng)相，柱溫為40℃，各雜質(zhì)峰和更昔洛韋峰分離良好。

2.3 專屬性試驗(yàn)

2.3.1 空白干擾試驗(yàn)

分別精密吸取1.3 中陰性樣品溶液、供試品溶液、混合雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F 濃度分別約為0.9，1.2，0.9，0.9，2.4 μg／mL）各20 μL，按1.2 色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到供試品溶液和對(duì)照品溶液色譜圖見圖1 和圖2。由圖可知，陰性樣品溶液在該位置及附近未出現(xiàn)峰，因此輔料不干擾主峰測(cè)定。

圖2 混合雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜圖

2.3.2 已知雜質(zhì)的定位及分離度試驗(yàn)

分別取1.3 中系統(tǒng)適用性溶液和雜質(zhì)定位溶液，按1.2 色譜條件進(jìn)行測(cè)定，依次對(duì)各雜質(zhì)定位，系統(tǒng)適用性溶液色譜圖見圖3。樣品與雜質(zhì)的定位與分離，結(jié)果列于表1，由表1 可以看出，主峰與相鄰雜質(zhì)及各雜質(zhì)之間分離度均大于1.5，各成分分離度良好，專屬性較強(qiáng)，表明方法適用可行。

2.3.3 強(qiáng)制降解試驗(yàn)

精密稱取更昔洛韋原料約12 mg，分別置于5只容量瓶中，依次進(jìn)行酸、堿、氧化、高溫、光照破壞，方法及結(jié)果列于表2。按1.2 色譜條件考察更昔洛韋降解情況，各物質(zhì)含量列于表3(≥0.02%)?？疾熘鞣迮c已知雜質(zhì)分離度及主峰的峰純度，結(jié)果列于表4。由表4 可知，各條件下主峰的峰純度均大于99.5%，主峰純度良好。

圖3 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖

2.3.4 強(qiáng)制降解試驗(yàn)

精密稱取更昔洛韋原料約12 mg，分置于5 只20 mL 容量瓶中，依次進(jìn)行酸、堿、氧化、高溫、光照破壞，破壞方法及試驗(yàn)結(jié)果列于表2。由表2 可知，降解方式并不影響主色譜峰的分離效果。按1.2 色譜條件測(cè)定各破壞條件下供試品溶液中更昔洛韋和雜質(zhì)含量，各物質(zhì)含量列于表3（≥0.02%）?？疾熘鞣迮c已知雜質(zhì)分離度及主峰的峰純度，結(jié)果列于表4。由表4 可知，各條件下主峰的峰純度均大于99.5%，主峰純度良好。

表1 樣品與已知雜質(zhì)的定位和分離試驗(yàn)

表2 破壞實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

表3 各破壞條件下供試品溶液中更昔洛韋和雜質(zhì)含量 %

表4 各破壞試驗(yàn)條件下更昔洛韋峰純度結(jié)果

2.4 線性方程、檢出限、定量限

取雜質(zhì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和更昔洛韋系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2 色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以更昔洛韋與各已知雜質(zhì)樣品溶液濃度（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。取系統(tǒng)適用性溶液和雜質(zhì)A，B，C，E，F(xiàn) 定位溶液，逐級(jí)稀釋，以3 倍的信噪比計(jì)算檢出限，以10 倍的信噪比定量限，按1.2 色譜條件進(jìn)行測(cè)定。線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、定量限和檢出限列于表5。

表5 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、定量限和檢出限

2.5 響應(yīng)因子的計(jì)算

依據(jù)2.4 線性測(cè)試結(jié)果，更昔洛韋與雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E 和雜質(zhì)F 的線性回歸方程斜率即為在不同濃度下測(cè)得峰面積與進(jìn)樣濃度比值，再計(jì)算各已知雜質(zhì)斜率與更昔洛韋斜率比值即為相對(duì)主成分的校正因子，更昔洛韋與各已知雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E 和雜質(zhì)F 的校正因子分別為1.0，1.0，1.3，1.0，1.0 和0.7，其中雜質(zhì)B 和雜質(zhì)F 的校正因子超出0.9～1.1 范圍，說(shuō)明雜質(zhì)B和雜質(zhì)F與主成分更昔洛韋在液相色譜上的響應(yīng)差異較大，應(yīng)改用雜質(zhì)對(duì)照品按照外標(biāo)法進(jìn)行定量更為準(zhǔn)確。

2.6 精密度試驗(yàn)

取同一批注射用更昔洛韋（批號(hào)：2017-1t），按1.3 方法制備供試品溶液和對(duì)照溶液，配制6 份，按照1.2 色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果列于表6。

表6 精密度試驗(yàn)結(jié)果 %

由表6 可知，6 份樣品中雜質(zhì)A 和雜質(zhì)B 均未檢出，雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E 和雜質(zhì)F 均有檢出，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%，表明方法精密度良好。

2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取同一批注射用更昔洛韋對(duì)照品溶液9 份，平均分為3 組；分別精密移取混合雜質(zhì)儲(chǔ)備工作溶液5，10，15 mL 各3 份，依次置入上述3 組容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容至刻度，搖勻，配制成回收率供試品溶液；再精密吸取雜質(zhì)儲(chǔ)備工作溶液2 mL，置入20 mL 量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)對(duì)照品溶液；精密量取上述回收率供試品溶液和雜質(zhì)對(duì)照液各20μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算回收率，結(jié)果列于表7。

表7 雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E 及雜質(zhì)F 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

由表7 可知，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E和雜質(zhì)F 的平均回收率為99.5%～105.0%，均小于3.0%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取系統(tǒng)適用性溶液于室溫下放置，按1.2 色譜條件分別于0，2，4，6，8，12 h 進(jìn)行測(cè)定，考察主峰及各已知雜質(zhì)峰面積變化情況，結(jié)果列于表8。

表8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表8 可知，系統(tǒng)適用性溶液室溫放置12 h，更昔洛韋及各已知雜質(zhì)峰面積無(wú)明顯變化，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，表明對(duì)照溶液室溫下放置12 h，穩(wěn)定性良好。

2.9 耐受性試驗(yàn)

取系統(tǒng)適用性溶液，對(duì)該方法的耐受性進(jìn)行考察。在流量為1.5 mL／min，柱溫為40℃，流動(dòng)相為0.05%三氟乙酸溶液-乙腈（50∶50）基礎(chǔ)上，將流量改為1.4 mL／min 和1.6 mL／min，柱溫改為38℃和42℃，流動(dòng)相比例改為0.05%三氟乙酸溶液-乙腈（55∶45）和0.05%三氟乙酸溶液-乙腈（45∶55），色譜柱改為HICHROM PARTISIL（10 μm SCX，4.6×250 mm，Lot No：E2117），分別考察了系統(tǒng)適用性溶液中主峰與相鄰雜質(zhì)E 以及各雜質(zhì)之間分離情況。

試驗(yàn)結(jié)果表明各種條件下主峰與雜質(zhì)E 分離度均為1.7，大于1.5，未發(fā)生明顯變化，符合分離度要求，雜質(zhì)B 與雜質(zhì)C 之間分離度最小為1.4，也達(dá)到分離基線。調(diào)整色譜條件，出峰順序未發(fā)生改變，依次為雜質(zhì)A，B，C，D，E、更昔洛韋及雜質(zhì)F，結(jié)果表明各種色譜參數(shù)波動(dòng)不影響有關(guān)物質(zhì)測(cè)定。該方法耐受性良好，適用于注射用更昔洛韋有關(guān)物質(zhì) 檢測(cè)。

2.10 樣品測(cè)定

按所建方法，對(duì)3 批注射用更昔洛韋和2 批更昔洛韋原料中的雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E 和雜質(zhì)F 進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表9。

表9 注射用更昔洛韋和原料雜質(zhì)測(cè)定結(jié)果 %

3 結(jié)語(yǔ)

建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定注射用更昔洛韋和原料中6 中已知雜質(zhì)含量的測(cè)定方法，該方法簡(jiǎn)單快捷，專屬性強(qiáng)，精密度好，可用于注射用更昔洛韋和原料中更昔洛韋和雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E 和雜質(zhì)F 含量的檢測(cè)，為更好地控制更昔洛韋原料及制劑的質(zhì)量提供了參考依據(jù)。