魏 娜，岳曉鳳，余秋玉，張飛龍

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測研究所，西藏拉薩 850032； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北武漢 430062)

青稞、小麥在西藏種植歷史悠久，播種面積大，適應(yīng)范圍廣，從海拔2 500 m以下的河谷坡地到4 200 m左右的湖濱平原(青稞種植上限最高可達(dá)海拔4 500 m)均有種植，其中青稞是西藏優(yōu)勢特色作物和藏民族賴以生存繁衍的基本口糧作物，種植面積占糧食生產(chǎn)總面積的70%左右，且具有高營養(yǎng)、高保健功能、高附加值等特點(diǎn)[1]。小麥在西藏糧食生產(chǎn)中僅次于青稞，從藏東南濕潤、半濕潤地區(qū)到西部半干旱、干旱地區(qū)廣大農(nóng)區(qū)均有種植。因此，青稞、小麥質(zhì)量安全直接關(guān)系到西藏農(nóng)業(yè)發(fā)展和人民的身體健康。真菌毒素是由曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)、鏈格孢屬(Alternaria)等真菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，廣泛污染谷物、食品以及飼料等，可致癌、致畸、致突變，嚴(yán)重威脅人畜健康[2]。目前，已發(fā)現(xiàn)超過400種真菌毒素，其中黃曲霉毒素(aflatoxins)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol)、玉米赤霉烯酮(zearalenone)、赭曲霉毒素A(ochratoxinA)、伏馬毒素B(fumonisinB)、T-2毒素等是污染谷物的主要真菌毒素，可發(fā)生在作物田間生長階段或收獲后儲藏階段[3]。真菌毒素對糧食作物的污染是一個全球普遍存在的問題，包括我國在內(nèi)的世界各國的農(nóng)產(chǎn)品都不同程度地遭受真菌毒素污染。西藏高原是地球上極具特色的地理單元，有“世界屋脊”、“地球第三極”之稱，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)區(qū)海拔跨度為 2 000～4 200 m，土壤因子以及溫度、降雨、紫外輻射等氣候因素會隨海拔高度而改變，從而在高度梯度上形成復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境，影響農(nóng)作物和真菌的生長。已有研究初步表明，西藏糧油作物存在真菌毒素污染風(fēng)險[4-6]，但目前對其深入、系統(tǒng)的研究較少。本研究擬以西藏青稞、小麥為研究對象，對其籽粒中多種毒素進(jìn)行檢測、分析，并對毒素陽性樣品中污染真菌進(jìn)行分離、鑒定，以期探明西藏青稞、小麥中污染真菌的種類和分布及其產(chǎn)毒類型，為西藏高原農(nóng)作物的真菌毒素污染減控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為來自西藏4個地市11個縣(區(qū))2018年收獲的青稞94份、小麥55份，共計149份。其中拉薩市達(dá)孜縣5份，林周縣6份，墨竹工卡縣6份；林芝市察隅5份，波密縣48份，巴宜區(qū)5份；昌都市卡若區(qū)52份，八宿縣37份，左貢縣34份，察雅縣3份；阿里地區(qū)普蘭縣20份。

圖1 采樣點(diǎn)分布圖

1.2 真菌毒素的測定

稱取5 g樣品(精確到 0.02 g)，加入 10 mL 水充分浸潤后，再加入 10 mL 的 1∶9甲酸/乙腈，室溫下150 r·min-1振蕩提取1 h。加入QuEChERS鹽包，8 800 r·min-1離心5 min；取 1 mL濾液直接加入SPE小柱，待流干后加入 0.5 mL 乙腈洗脫，吹干，收集全部流出液。用乙腈水溶液(1∶1)定容到1 mL，過 0.22 μm有機(jī)濾膜后，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)、赭曲霉毒素(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、3-乙酰基-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-AcDON)、15-乙酰基-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-AcDON)、雜色曲霉毒素(ST)、伏馬毒素 B1(FB1)、伏馬毒素B2(FB2)、雪腐鐮刀菌烯醇(NIV)、HT-2、T-2共15種毒素。色譜條件為：C18色譜柱，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為1 μL；流動相A為2 mol·L-1(含0.1%甲酸)乙酸銨，流動相B為甲醇。噴霧電壓為5 500 V，鞘氣為 60 psi，輔氣為55 psi，離子源溫度為550 ℃。

1.3 真菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定參考《真菌鑒定手冊》[7]。采用TIANGEN公司真菌基因組抽提試劑盒提取總 DNA。PCR擴(kuò)增采用通用引物ITS1/ITS4。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：1.0 μLDNA模板，5.0 μL 10×Buffer，1.0 μLTaq聚合酶，1.0 μL dNTP，引物ITS1和ITS4各1.5 μL，39.0 μL ddH2O。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。取2 μL PCR 產(chǎn)物，用1%瓊脂糖電泳進(jìn)行產(chǎn)物檢測。擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海桑尼生物科技有限公司測序，利用 BLAST 軟件將測定得到的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料中真菌毒素污染分布

149份供試樣品中共有30份被檢出真菌毒素(20.13%)，其中青稞樣品16份(17.02%)，小麥樣品14份(25.45%)。

在被測樣品中存在OTA、ZEN、ST、15-DON、AFB2共5種毒素污染，檢出率分別為 4.70%、4.70%、10.74%、0.67%、2.68%。以ST檢出率最高，含量為3.28～109.5 μg·kg-1,平均含量為0.12 μg·kg-1。OTA陽性樣品中，OTA含量為 0.89～429.10 μg·kg-1，依據(jù)GB 2761-2017標(biāo)準(zhǔn)，3.36%樣品超出國家限量標(biāo)準(zhǔn)；ZEN陽性樣品中的ZEN含量范圍為6.94～ 543.40 μg·kg-1，超標(biāo)率為1.34%；其他3種毒素因未有限量標(biāo)準(zhǔn)，暫不做判定。

青稞樣品中，毒素總檢出率為19.15%，毒素總超標(biāo)率為5.32%；以O(shè)TA檢出率最高(6.38%)，超標(biāo)率為4.26%，最高含量為429.10 μg·kg-1；其次是ZEN，檢出率為5.32%，超標(biāo)率為1.06%，最高含量為543.40 μg·kg-1；第三是ST，檢出率為4.26%，最高含量為54.47 μg·kg-1。小麥樣品中，毒素總檢出率為 25.45%，毒素總超標(biāo)率為3.64%。以ST檢出率最高，為21.82%，最高含量為109.50 μg·kg-1；其次是ZEN，檢出率為3.64%，超標(biāo)率為 1.82%，最高含量為182.70 μg·kg-1(表1)。

表1 青稞和大麥中的真菌毒素污染

2.2 供試材料中主要產(chǎn)毒真菌分布

于42份被真菌毒素污染的籽粒樣品中共分離到199份真菌，分屬23屬67種，其中青霉屬(Penicillium)20種，曲霉屬(Aspergillus)7種，枝孢霉屬(Cladosporium)5種，籃狀菌屬(Talaromyces)4種，毛殼屬(Chaetomium)4種，毛霉屬(Mucor)3種，鐮孢屬(Fusarium)3種，鏈格孢屬(Alternaria)3種，節(jié)菱孢屬(Arthrinium)2種，Dichotomopilus屬2種，橫梗霉屬(Lichtheimia)2種，根霉屬(Rhizopus)、枝頂孢霉屬(Acremonium)、筍頂孢霉屬(Acrostalagmus)、黑管菌屬(Bjerkandera)、帚枝霉屬(Sarocladium)、木霉(Trichoderma)、單端孢屬(Trichothecium)、輪枝孢屬(Verticillium)、附球菌屬(Epicoccum)、派倫霉屬(Peyronellaea)、Pleosporales屬、Pseudogymnoascus屬各1種。23屬中，青霉屬為優(yōu)勢屬，占分離菌株總數(shù)的比例(占比)高達(dá) 48.74%；曲霉屬次之，占18.09%；其他屬的占比詳見表2。

表2 產(chǎn)毒真菌種類及百分比

26份青稞樣品中，共分離到119株真菌，分屬18屬48種。青霉屬占比最高，為52.94%；曲霉屬次之，占比為18.49%；毛殼屬、附球菌屬占比均為3.90%；枝孢霉屬、根霉屬占比均為 3.36%；節(jié)菱孢屬、橫梗霉屬分離頻度均為 2.52%；鐮刀菌屬、毛霉屬屬、籃狀菌屬、帚枝霉屬占比均為1.68%；其他屬占比和為0.82%。48種菌株中，P.granulatum占比最高，為 10.08%，P.chrysogenum占比為7.56%(表3)。

表3 青稞中產(chǎn)毒真菌種類及百分比

16份小麥樣品中，共分離到80株真菌，分屬14屬33種。青霉屬占比最高，為42.50%；曲霉屬次之，占比為17.50%；枝孢霉屬、帚枝霉屬占比為均6.25%；鏈格孢屬占比為5.00%；枝頂孢霉屬、鐮刀菌屬、米根霉屬、單端孢屬占比均為 2.50%；其他屬占比和為1.25%。48種菌株中，P.chrysogenum占比最高，為12.50%，其次為A.versicolor占比為10.00%，P.granulatum占比為7.50%(表4)。

表4 小麥中產(chǎn)毒真菌種類及百分比

3 討 論

本研究對149份西藏青稞和小麥中的15種真菌毒素污染研究發(fā)現(xiàn)，毒素總檢出率、總超標(biāo)率為20.13%、6.00%，高于前期研究報道的 2.40%、0.93%[6]。Martina等[8]對捷克52個大麥及麥芽中17種真菌毒素污染的研究結(jié)果表明，所有樣品都存在至少兩種毒素的污染，且所有樣品都受到恩鐮孢菌素(Enniatins)污染，均未受到AFB1、AFB2、AFG1、AFG2及OTA的污染；Alexandra[9]對捷克大麥中鐮刀菌毒素的研究表明，83%的大麥均受到DON的污染。本研究表明，青稞污染多以單個真菌毒素污染為主，交叉污染占比僅為 2.13%，以O(shè)TA、ST污染相對較為嚴(yán)重；鐮刀菌中以ZEN污染為主。這可能是由于西藏高海拔氣候環(huán)境下菌群分布的差異導(dǎo)致真菌毒素種類有所不同。

研究表明，雜色曲霉毒素能誘發(fā)實(shí)驗動物產(chǎn)生多種腫瘤，且與人類胃癌、肝癌的發(fā)生有一定的相關(guān)性[10-11]。歐洲食品安全局(EFSA)調(diào)查了來自9個歐洲國家400 份谷物樣品，發(fā)現(xiàn)小麥、黑麥、大麥樣品中ST污染率為2%～6%，平均含量低于1.5 μg·kg-1[12]。Kovalenko等[13]對俄羅斯 350份谷物樣品中ST進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)小麥、玉米和大麥中的檢出率分別為0～21%、5%～8%和1%～23%。國內(nèi)研究者發(fā)現(xiàn)，我國糧食中雜色曲霉污染較為嚴(yán)重，上世紀(jì)九十年代末期，山東省小麥毒素污染率高達(dá)89.8%，大米毒素污染率為41.5%；浙江省大米污染率為17.5%[14-15]。20世紀(jì)初，田禾菁等[16]對中國東北、華東、華中、西南、西北共 12個省市的小麥、玉米和大米共 1 580份樣品進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)其雜色曲霉素平均污染量分別為68.9、32.2、13.9 μg·kg-1，污染率分別為98%、89%和 72%。本研究中，西藏地區(qū)小麥中雜色曲霉毒素檢出率為21.82%，陽性樣品中平均含量為17.94 μg·kg-1，檢出率及平均含量雖低于上述報道，但鑒于ST的致癌性，對西藏的糧食安全及其人民的健康仍有一定的威脅。目前，我國暫時沒有規(guī)定食品中雜色曲霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)，建議相關(guān)部門加快制定雜色曲霉限量標(biāo)準(zhǔn)，以保障居民身體健康。

已有的研究表明，產(chǎn)OTA主要菌為赭曲霉、碳黑曲霉、疣孢青霉。部分報道洋蔥曲霉(Aspergiliusalliaceu)、蜂蜜曲霉(Aspergiliusmelleus)、佩特曲霉(Aspergiliuspetrakii)、硫色曲霉(Aspergiliussulphureus)、(Aspergiliusalbertensis)金頭曲霉(Aspergiliusauricomus)也能產(chǎn)OTA[17]。赭曲霉最佳生長溫度為24 ℃～31 ℃，是在熱帶和亞熱帶地區(qū)OTA污染的主要產(chǎn)生菌；疣孢青霉最佳生長溫度為20 ℃，0 ℃環(huán)境下也能生長，是加拿大和歐洲等寒冷地區(qū)OTA污染的主要產(chǎn)生菌[18]。西藏自治區(qū)海拔高，氣候寒冷，年平均氣溫為 5 ～ 6 ℃，OTA在全區(qū)污染較為普遍，且被污染樣品毒素含量較高，陽性樣品中平均含量高達(dá)186.94 μg·kg-1，而在陽性樣品中僅分離到疣孢青霉，因此，推測疣孢青霉能耐低溫，且產(chǎn)OTA的能力較強(qiáng)。

鏈格孢菌能產(chǎn)生70多種有毒代謝物，且對人或動物危害較大，甚至某些鏈格孢毒素還有致畸、致癌、致突變作用[19]。國內(nèi)外研究表明，鏈格孢毒素在麥類作物中污染較為普遍[20-22]。本研究中，我們分離到Alternariatenuissima、Alternariaalternata兩種鏈格孢菌。因此，應(yīng)加快鏈格孢毒素在高原農(nóng)作物中的污染水平和菌群分布 研究。

鐮刀菌可產(chǎn)生很多類型的毒素，如DON、ZEN、T-2毒素等。本研究發(fā)現(xiàn)，供試樣品中鐮刀菌毒素檢出比例較高，但許多被鐮刀菌毒素污染的樣品卻未分離到鐮刀菌，究其原因：一是適應(yīng)力較強(qiáng)的菌種過度生長繁殖，抑制相對生長緩慢的鐮刀菌生長；二是由于環(huán)境的改變或其他原因，菌株在儲藏過程中失活。如本研究一個陽性樣品中ZEN含量高達(dá)366.72 μg·kg-1，但未從該樣品中分離到鐮刀菌，僅分離到白黃筍頂孢霉菌株，據(jù)報道該菌對鐮刀菌有一定的抑制作用[23]，是否是其抑制鐮刀菌生長有待于進(jìn)一步研究。因此，深入探討農(nóng)作物固有的有益真菌與產(chǎn)毒真菌的競爭關(guān)系及機(jī)理可為高原真菌毒素綠色防控提供理論基礎(chǔ)。