趙梓頤，徐永清，董佳敏，武佳文，彭麗娜，馮 旭，馮珊珊，胡寶忠，2，李鳳蘭

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.哈爾濱學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150086)

膨脹素蛋白(expansin)于1992年在黃瓜(Cucumissativus)的下胚軸中首次被發(fā)現(xiàn)，其以非酶活性作用機(jī)制并在酸性環(huán)境條件下可以松弛植物的細(xì)胞壁[1]。在植物中，Expansin超家族被分成四個(gè)亞家族，分別為α-expansin(EXPA)、β-expansin(EXPB)、expansin-like A(EXLA)和expansin-like B(EXLB)，家族成員之間相對(duì)保守，氨基酸序列同源性介于20%～25%之間[2]。研究表明，膨脹素在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用，包括營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、根的伸長(zhǎng)、花的發(fā)育、果實(shí)成熟及軟化、種子結(jié)實(shí)量等[3]。

非生物脅迫引起的細(xì)胞壁修飾是植物適應(yīng)環(huán)境的重要組成表現(xiàn)，而細(xì)胞壁形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變是由膨脹素等細(xì)胞壁修飾蛋白所調(diào)節(jié)，因此膨脹素也廣泛地參與了植物對(duì)外界非生物脅迫的響應(yīng)[4]。在玉米(Zeamays)和水稻(Oryzasativa)中，膨脹素基因的表達(dá)受水分脅迫所誘導(dǎo)[5]；在脫水的玫瑰(Rosahybrida)花瓣中，膨脹素基因RhEXPA4的表達(dá)顯著上調(diào)[6]；大麥(Hordeumvulgare)中的膨脹素基因HvEXPB7通過促進(jìn)根毛的生長(zhǎng)來提高植物干旱脅迫的耐受性[7]。

低溫脅迫使農(nóng)作物減產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，東農(nóng)冬麥2號(hào)(D2)作為高抗寒的冬小麥品種，具有寶貴的抗寒基因資源[8]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，D2中膨脹素基因TaEXPB7-B的表達(dá)在D2中受低溫脅迫下的ABA信號(hào)傳導(dǎo)途徑所調(diào)控，且過表達(dá)TaEXPB7-B、TaEXPA8-B/D基因顯著促進(jìn)了擬南芥的生長(zhǎng)和低溫脅迫耐受性[9-10]。Zhang等[11]對(duì)小麥進(jìn)行全基因組分析后鑒定出128個(gè)膨脹素基因，其中TaEXPA7-A/B/D基因作為其中的成員已被證實(shí)參與冬小麥對(duì)外界低溫脅迫的響應(yīng)。董佳敏等[12]在D2中克隆了TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因，并證明了這三個(gè)基因的表達(dá)可能與D2的根系建成及低溫脅迫耐受性相關(guān)。

為進(jìn)一步揭示TaEXPA7-A/B/D基因的功能，本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因分別轉(zhuǎn)入模式植株擬南芥中，同時(shí)探討了TaEXPA7-A/B/D基因?qū)χ参锷L(zhǎng)和低溫耐受性的影響，以期為冬小麥膨脹素的研究提供新的理論基礎(chǔ)，也同時(shí)為作物分子育種提供優(yōu)質(zhì)的基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)所用擬南芥品種為哥倫比亞(Colombia)野生型擬南芥，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院植物資源與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 載體及菌株

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 pBI121-TaEXPA7-A/B/D表達(dá)載體的構(gòu)建

通過PCR在TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因的上下游分別添加XbaI和BamHI酶切位點(diǎn)，所用引物見表1所示。利用限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI對(duì)上述PCR產(chǎn)物和pBI121質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)并送交測(cè)序。

1.3.2 載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

分別將pBI121-TaEXPA7-A/B/D三個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，對(duì)陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定，所用引物見表1。

1.3.3 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥，步驟參考Feng等[9]的方法。陽性轉(zhuǎn)基因植株的鑒定參考Peng等[10]的方法，通過RT-PCR對(duì)T1代植株進(jìn)行鑒定，所用引物見表1。

表1 TaEXPA7-A/B/D基因添加XbaI和BamHI酶切位點(diǎn)所用引物信息

1.3.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的形態(tài)學(xué)觀察

分別將野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子播種于1/2 MS固體培養(yǎng)基上，7 d后觀察植株根部的生長(zhǎng)狀態(tài)并測(cè)定根長(zhǎng)，待植株生長(zhǎng)至4葉期后播種于營(yíng)養(yǎng)缽(營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)中并放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(16/8 h光周期，25/20 ℃晝夜溫度)，15 d后觀察葉片生長(zhǎng)情況，30 d后觀察并測(cè)定株高，花序出現(xiàn)后分別統(tǒng)計(jì)花后1～3周單個(gè)植株的花序和角果數(shù)目。對(duì)于側(cè)根的觀察，擬南芥種子播種于1/2 MS垂直板上，10 d后觀察并統(tǒng)計(jì)植株的側(cè)根數(shù)目。

1.3.5 低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥生理指標(biāo)的 影響

擬南芥的種植方法同1.3.4，取生長(zhǎng)40 d且長(zhǎng)勢(shì)一致的植株置于4 ℃培養(yǎng)箱中，分別于處理后0、3、6 d剪取擬南芥葉片。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的活性，以及丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)和可溶性糖含量的測(cè)定均按照試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均至少重復(fù)3次(n=9)，數(shù)據(jù)顯示為平均值±SD，GraphPad Prism 5用于差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pBI121- TaEXPA7-A/B/D表達(dá)載體的構(gòu)建

在TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因的上下游分別添加XbaI和BamHI酶切位點(diǎn)，PCR結(jié)果如圖1所示。對(duì)pBI121及上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切并連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，提取菌落進(jìn)行PCR并測(cè)序，陽性菌落的PCR檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。將測(cè)序結(jié)果正確的pBI121-TaEXPA7-A/B/D質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中，陽性菌落的PCR鑒定結(jié)果如圖3所示。條帶大小與圖1和圖2一致，說明TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因成功整合進(jìn)植物表達(dá)載體中。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000；1： TaEXPA7-A； TaEXPA7-B； TaEXPA7-D。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000；1：pBI121-TaEXPA7-A；2：pBI121-TaEXPA7-B；3：pBI121-TaEXPA7-D。圖3同。

2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定

對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代植株的RT-PCR鑒定結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因已成功轉(zhuǎn)化至擬南芥中并表達(dá)。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000；1：野生型(WT)植株；2和3： TaEXPA7-A轉(zhuǎn)基因植株；4和5： TaEXPA7-B轉(zhuǎn)基因植株；6和7： TaEXPA7-D轉(zhuǎn)基因植株。

2.3 過表達(dá) TaEXPA7-A/B/D基因擬南芥的形態(tài)學(xué)分析

對(duì)在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d的擬南芥植株進(jìn)行根部觀察，并測(cè)定根長(zhǎng)，結(jié)果(圖5，表2)顯示，TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因的過表達(dá)顯著促進(jìn)了植株根的伸長(zhǎng)和根毛的生長(zhǎng)。對(duì)在垂直板上生長(zhǎng)10 d的擬南芥植株進(jìn)行側(cè)根觀察，并統(tǒng)計(jì)側(cè)根數(shù)目，結(jié)果(圖6，表2)顯示，過表達(dá)TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因植株的平均側(cè)根數(shù)目分別為 40.00、46.00和35.67，均顯著高于野生型。TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因?qū)M南芥葉片生長(zhǎng)及株高的影響。結(jié)果(圖7，表2)表明，轉(zhuǎn)基因植株的葉片數(shù)目顯著多于野生型，且TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因轉(zhuǎn)基因植株的株高相比于野生型分別顯著增加了10.18%、20.25%和8.89%。TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因的過表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥花序和角果數(shù)目的影響。結(jié)果(表3)顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在花后1～2周的花序數(shù)和角果數(shù)均顯著低于野生型；而花后3周，轉(zhuǎn)基因擬南芥的花序和角果生長(zhǎng)迅速，過表達(dá)TaEXPA7-A/B兩個(gè)基因擬南芥的花序數(shù)目和過表達(dá)TaEXPA7-A/D兩個(gè)基因擬南芥的角果數(shù)均顯著高于野生型。

表3 野生型和過表達(dá) TaEXPA7-A/B/D基因擬南芥植株花序和角果數(shù)目的比較

表2 野生型和過表達(dá) TaEXPA7-A/B/D基因擬南芥植株主要特征性狀的比較

A為葉片形態(tài)；B為株高表型。

圖6 TaEXPA7-A/B/D基因?qū)D(zhuǎn)基因擬南芥?zhèn)雀L(zhǎng)的影響

A：根長(zhǎng)形態(tài)；B和C：根毛的生長(zhǎng)狀態(tài)。

2.4 TaEXPA7-A/B/D基因?qū)M南芥在低溫脅迫下生理指標(biāo)的影響

對(duì)野生型和過表達(dá)TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因擬南芥植株在4 ℃處理下的生理指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果(表4)顯示，轉(zhuǎn)基因植株中抗氧化酶SOD、POD及CAT的活性相比于野生型在正常生長(zhǎng)條件和4 ℃處理下均維持在較高的水平，且MDA的積累量較低。在低溫處理6 d后，過表達(dá)TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因擬南芥中SOD的活性分別為590.18、691.44和610.94 U·g-1，均顯著高于野生型。低溫處理3 d后，野生型植株中POD的活性提高了115.91%，為950 U·g-1，分別為轉(zhuǎn)TaEXPA7-A/B/D基因植株的 25.13%、27.86%和21.49%。過表達(dá)TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因擬南芥中MDA的含量在處理后6 d分別為11.61、12.56和11.95 nmol·g-1，均顯著低于野生型。正常生長(zhǎng)條件下野生型及轉(zhuǎn)基因植株中脯氨酸的含量并無顯著差異，但在低溫處理3 d后過表達(dá)TaEXPA7-A植株中脯氨酸的含量顯著增加，為野生型的1.42倍。植株中可溶性糖含量的測(cè)定結(jié)果顯示，正常生長(zhǎng)條件下轉(zhuǎn)基因植株中的含量均維持在較低的水平，顯著低于野生型；但隨低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，野生型植株中的含量逐漸下降，而轉(zhuǎn)基因植株中則呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，在處理后6 d轉(zhuǎn)TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因擬南芥中可溶性糖的含量均顯著高于野生型，分別為5.63、6.64和5.35 mg·g-1。

表4 低溫脅迫下野生型和過表達(dá) TaEXPA7-A/B/D基因擬南芥植株中生理指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

3 討 論

膨脹素基因的過表達(dá)能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，這一觀點(diǎn)已經(jīng)被很多研究所證實(shí)，如在擬南芥中過表達(dá)玫瑰的膨脹素基因RhEXPA4能夠增加植株的側(cè)根數(shù)[13]；水稻中OsEXPB2基因可以通過調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)以影響植株根系的發(fā)育。本研究的結(jié)果顯示，TaEXPA7-A/B/D基因的過表達(dá)顯著促進(jìn)了擬南芥的生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因植株的根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)目、葉片數(shù)目和株高均顯著高于野生型。在植物中，根系負(fù)責(zé)吸收養(yǎng)分和水分，為植株的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量并起固定和支撐地上部分的作用[14]。茂密的側(cè)根可以使植物更好地吸收營(yíng)養(yǎng)，從而在一定程度上提高其對(duì)高溫、干旱等非生物脅迫的耐受性[15]，因此TaEXPA7-A/B/D基因可以作為農(nóng)業(yè)分子育種的候選基因資源。也有研究表明，膨脹素基因能夠影響植物花的發(fā)育及種子的產(chǎn)量，如在紫茉莉(Mirabilisjalapa)中，不同的α-膨脹素基因分別參與了花的生長(zhǎng)、盛開和衰敗的過程[16]；在煙草(Nicotianatabacum)中，過表達(dá)小麥膨脹素基因TaEXPA2不僅顯著增加了煙草種子結(jié)實(shí)量而且增加了種子的體積[17]。本研究證明了TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因?qū)M南芥花序和角果的發(fā)育均起顯著的促進(jìn)作用，表明該基因?qū)μ岣咿r(nóng)作物產(chǎn)量具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

研究表明，膨脹素基因還可以提高植物對(duì)外界非生物脅迫的耐受性，如過表達(dá)小麥膨脹素基因TaEXPB23顯著降低了轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫下的失水速度[18]；在擬南芥中過表達(dá)AtEXPA2基因增加了植株對(duì)鹽脅迫的耐受性，而敲除該基因的突變體植株則呈現(xiàn)相反的表型[19]；從冬小麥D2中分離的膨脹素基因TaEXPB7-B顯著提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)低溫脅迫的耐受性和存活率，且轉(zhuǎn)基因植株中抗氧化酶的活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量與野生型相比均維持在較高水平[9]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因擬南芥植株在低溫脅迫下抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性和可溶性糖的含量均顯著高于野生型，MDA的積累量也較低，與前人研究結(jié)果一致?？寡趸改軌蚣皶r(shí)清除低溫脅迫下植物細(xì)胞中所產(chǎn)生的大量自由基和活性氧，對(duì)維持膜系統(tǒng)穩(wěn)定性起到關(guān)鍵的作用[20]?？扇苄蕴亲鳛闈B透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，對(duì)于維持低溫脅迫下植物細(xì)胞中滲透壓的穩(wěn)定具有重要作用[21]。因此，TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因可以增加轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)低溫脅迫的耐受能力，但該基因影響抗氧化酶活性和相關(guān)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。