郭富燁，蒼 晶，盧秋巍，田 宇，宋春華，任志鵬，孫仙澤，樊曉培，王多佳，付連雙

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030; 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

普通小麥(TriticumaestivumL.)是世界上最重要的農(nóng)作物之一。由于自身異源六倍體(2n=6x=42，AABBDD)的特殊性，擁有著龐大而復(fù)雜的基因組，直到2018年其全基因組序列才全部公布[11]。普通小麥?zhǔn)峭ㄟ^(guò)培育的四倍體小麥(2n=4x=28，AABB)與二倍體節(jié)節(jié)麥(2n=14，DD)雜交獲得[12]。因?yàn)槠胀ㄐ←溇哂挟愒戳扼w的特殊性，所以是進(jìn)化研究的珍貴材料。本研究對(duì)普通小麥的CBS基因進(jìn)行了全基因組分析，了解小麥CBS基因的特征，以期為研究小麥CBS基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小麥CBS基因家族成員的鑒定

首先，在水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中找到CBS蛋白，作為對(duì)本地BLASTP程序的Queries(E value ≤1e-5)。利用Pfam(http://pfam.xfam.org/)[13]和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)[14]驗(yàn)證CBS結(jié)構(gòu)域是否存在。使用InterProScan程序[15]手動(dòng)確認(rèn)模糊序列，最后刪除冗余的序列，根據(jù)它們結(jié)構(gòu)域信息以及在基因組的位置進(jìn)行命名。

1.2 小麥CBS結(jié)構(gòu)域蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

使用Cluster X(v2.0)生成多序列比對(duì)[16]。使用MEGA 7.0軟件[17]的最大似然法(ML)構(gòu)建無(wú)根系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap設(shè)置為1000。通過(guò)在線網(wǎng)站(https://itol.embl.de/)對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行美化[18]。

1.3 小麥CBS基因結(jié)構(gòu)分析以及CBS蛋白保守功能基序預(yù)測(cè)

從小麥基因組序列文件(GFF3格式)中提取CBS基因的基因組信息和編碼序列，并分析CBS基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。利用MEME(http://me-me-suite.org/)預(yù)測(cè)CBS蛋白序列的保守基序，重復(fù)設(shè)定為zero or one，最佳寬度為6～50個(gè)氨基酸殘基，最大基序數(shù)為10。利用MCScanX[19]對(duì)小麥進(jìn)行共線性分析，刪除重復(fù)基因?qū)?shù)≤30的共線性區(qū)域以及基因?qū)﹂g相對(duì)位置<2×106bp的影響，用TBtools進(jìn)行可視化[20]和表達(dá)譜的繪制。

1.4 小麥CBS基因家族在低溫脅迫下的表達(dá)模式分析

從SRA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov//sra/?term=SRP043554)[21]以及實(shí)驗(yàn)室高通量測(cè)序獲取轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)樣品為強(qiáng)抗寒性冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號(hào)(Dn1)(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥育種實(shí)驗(yàn)室付連雙老師提供)，2015年9月10日播種于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田，行長(zhǎng)2 m，行距0.2 m，10行區(qū)。播種量450 ?！-2，播深5 cm，常規(guī)田間管理；在大田自然降溫連續(xù)10 d平均最低溫度降至 5 ℃、-10 ℃和-25 ℃時(shí)，剪取分蘗節(jié)用于測(cè)定。實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)證明Dn1具有抗極低溫的能力，與葉片相比，分蘗節(jié)受到的損害較小，是抗寒的重要器官[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥CBS基因家族的鑒定結(jié)果及蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)

根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中CBS蛋白序列，通過(guò)BLASTP搜索小麥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository)，比對(duì)并鑒定CBS候選基因。進(jìn)一步利用NCBI以及Pfam檢驗(yàn)CBS候選基因是否含有完整的結(jié)構(gòu)域，并刪除不具有CBS保守結(jié)構(gòu)域的序列。去除冗余序列后在小麥中共鑒定出136個(gè)CBS基因，并根據(jù)基因在染色體上的位置命名(表1)。

表1 小麥中CBS基因家族

2.2 CBS基因家族的進(jìn)化分析

為了解小麥CBS基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，使用ML構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可見CBS基因可分為8個(gè)亞家族(A、B、C、D、E、F、G、H)(圖1)，每個(gè)亞家族都有明顯的特征。A組僅有3個(gè)CBS基因，它們包含一個(gè)五肽重復(fù)序列(pentatricopeptide repeat，PPR)和CBS結(jié)構(gòu)域；B組有35個(gè)CBS基因，它們由一個(gè)氯化物通道蛋白(chloride channel，CLC)和CBS結(jié)構(gòu)域構(gòu)成(TaCBS-CLC-9B-2上并沒有發(fā)現(xiàn)CLC結(jié)構(gòu)域)；C組有3個(gè)CBS基因，它們由一個(gè)肌苷5'-單磷酸脫氫酶(inosine-5'-monophosphate dehydrogenase，IMPDH)構(gòu)成，且CBS結(jié)構(gòu)域位于IMPDH結(jié)構(gòu)域中；D組可分為兩個(gè)亞組D1、D2：D1組有21個(gè)CBS基因，它們僅含有一個(gè)CBS結(jié)構(gòu)域，D2組含有15個(gè)CBS基因，它們由未知功能的DUF21結(jié)構(gòu)域和一個(gè)CBS結(jié)構(gòu)域組成；E組有3個(gè)CBS基因，由糖異構(gòu)酶(sugar isomerase，SIS)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)CBS結(jié)構(gòu)域組成；F組有29個(gè)CBS基因，它們中存在1～2個(gè)CBS結(jié)構(gòu)域；G組含有6個(gè)CBS基因，該組基因由兩個(gè)CBS結(jié)構(gòu)域和一個(gè)AMP激活的蛋白激酶的糖原識(shí)別位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域(AMPK1_CBM)組成；H組有21個(gè)CBS基因，它們由兩個(gè)CBS結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Phox/Bemp1(PB1)結(jié)構(gòu)域(TaCBSD-PB1-3A-3，TaCBSD-PB1-3B-2僅含有一個(gè)CBS和一個(gè)PB1結(jié)構(gòu)域)。

圖1 使用最大似然法建立小麥CBS系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 CBS基因家族基因結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)保守基序分析

小麥?zhǔn)钱愒戳扼w，所以在其基因組上，絕大多數(shù)的基因都具有三個(gè)高度同源的基因，我們稱之為三聯(lián)體。通過(guò)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，CBS基因并不都是三聯(lián)體。對(duì)他們的蛋白序列以及motif分析發(fā)現(xiàn)，所有的CBS蛋白結(jié)構(gòu)域中保守的motif1(圖2)。進(jìn)化樹同一分支上的基因結(jié)構(gòu)相似，例如D1組含有的保守motif較少，大多數(shù)只含有motif1和motif9。相比之下，B組含有較多的保守motif，其中最多含有9個(gè)，大多數(shù)含有motif 1～7和motif9～10(TaCBS-CLC-9B-2只有一個(gè)CBS結(jié)構(gòu)域，可能是因?yàn)槠錅y(cè)序結(jié)果的質(zhì)量影響，且注釋不完全)，他們可能是CBS結(jié)構(gòu)域中特有的保守motif。通過(guò)保守基序分析發(fā)現(xiàn)三聯(lián)體有著相似的 結(jié)構(gòu)。

內(nèi)含子、外顯子的結(jié)構(gòu)、內(nèi)含子類型與數(shù)量是一個(gè)基因家族典型的進(jìn)化印跡。小麥三聯(lián)體之間的內(nèi)含子與外顯子數(shù)量相近且結(jié)構(gòu)組成相似(圖2)，如F組的內(nèi)含子均少于6個(gè)，H組的內(nèi)含子均多于10個(gè)，且結(jié)構(gòu)域都明顯被內(nèi)含子分割，并且?guī)缀跛械膬?nèi)含子都存在于編碼區(qū)，僅有少數(shù)基因的內(nèi)含子存在于非翻譯區(qū)(UTR)。

圖2 小麥CBS保守基序(左)與基因結(jié)構(gòu)(右)的鑒定

2.4 小麥CBS基因家族在染色體上的分布與重復(fù)

為了探究CBS基因在小麥中的進(jìn)化機(jī)制，本研究將CBS基因定位到染色體上。共定位了134個(gè)CBS基因(有2個(gè)未定位)，3號(hào)染色體上的CBS基因最多，其中3A和3B染色體上擁有11個(gè)CBS基因，3D染色體有10個(gè)CBS基因；1號(hào)染色體上的CBS基因最少，1A、1B、1D每條染色體上均只有2個(gè)CBS基因。在4A、4B和4D染色體上分別有5、5和6個(gè)CBS基因，5A、5B和5D染色體上分別有9、10和9個(gè)CBS基因。本研究還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)未定位的CBS基因，與7號(hào)染色體上TaCBS-11s在進(jìn)化上相似。隨后檢驗(yàn)了基因家族的復(fù)制事件(圖3)，共發(fā)現(xiàn)40對(duì)CBS三聯(lián)體，其中32對(duì)具有共線性，但是TraesCS6B 02G264200未被找到，經(jīng)預(yù)測(cè)其功能是未知的，沒有保守結(jié)構(gòu)域，但與TaCBS-9s擁有共線性?？赡苁瞧浔旧硎荂BS基因，但在進(jìn)化過(guò)程中突變導(dǎo)致自身功能消失。除三聯(lián)體外，在小麥染色體上還有不成三聯(lián)體的CBS基因，可能是本身不存在片段重復(fù)或者是小麥在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了串聯(lián)重復(fù)所致。

該線表示具有同線性，不同的顏色表示不同的鏈接組。A染色體-B染色體是紅線，A染色體-D染色體是藍(lán)線，B染色體-D染色體是綠線。

2.5 小麥CBS基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)

根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組文獻(xiàn)[21]，提取了CBS家族的TPM(transcripts per million reads)值，利用系統(tǒng)發(fā)育樹來(lái)分析小麥CBS家族的表達(dá)模式。發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫(4 ℃)下，葉片中大部分CBS基因的表達(dá)并沒有明顯變化，只有TaCBS-10B和TaCBS-5s響應(yīng)4 ℃的低溫脅迫(圖4)。參考本實(shí)驗(yàn)室前期凍害處理(5 ℃、-10 ℃和-25 ℃)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)5組三聯(lián)體對(duì)低溫均有積極的響應(yīng)，其中TaCBS-10s三聯(lián)體積極響應(yīng)-10 ℃低溫脅迫，表達(dá)量均在-10 ℃達(dá)到最高，在-25 ℃略有下降(圖5)；三組三聯(lián)體TaTlyc-2s、TaCBS-8s和TaCBSDCBS-1s則積極響應(yīng)-25 ℃低溫脅迫(圖5)，其中TaCBS-8s在 4 ℃(圖4)、5 ℃、-10 ℃(圖5)均不表達(dá)，但在-25 ℃表達(dá)量驟然升高，TaTlyc-2s和TaCBSDCBS-1s前期表達(dá)量變化不大，在-25 ℃表達(dá)量驟然升高。三聯(lián)體TaCBS-5s在4 ℃表達(dá)量最高，在-10 ℃和-25 ℃表達(dá)量無(wú)明顯變化，可能是在前期已經(jīng)響應(yīng)低溫達(dá)到峰值，但在低溫條件下較高的表達(dá)量也說(shuō)明了它們?cè)谥参锏钟鶅龊Φ倪^(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

TPM：每百萬(wàn)reads中的轉(zhuǎn)錄本reads數(shù)。

Cold-1、Cold-2、Cold-3代表4 ℃處理2周。

3 討 論

CDCP可以通過(guò)與Trxs相互作用來(lái)清除ROS，所以其對(duì)于植物進(jìn)行正?；顒?dòng)是必需的。然而目前關(guān)于在植物中對(duì)CBS基因進(jìn)行系統(tǒng)分析的報(bào)道較少，在小麥中更是未見報(bào)道。在擬南芥中，定位于葉綠體中的CBSX1和CBSX2通過(guò)調(diào)節(jié)硫氧還蛋白從而控制H2O2水平并調(diào)節(jié)花藥內(nèi)皮細(xì)胞中的木質(zhì)素聚合；還可以通過(guò)調(diào)節(jié)Trxs的穩(wěn)態(tài)來(lái)影響光合作用相關(guān)酶的活性，從而影響植物生長(zhǎng)[23]。在水稻中，OsCBSX3和OsCBSX4可以調(diào)節(jié)水稻對(duì)于生物和非生物脅迫的耐受性[24-25]，在本研究中也發(fā)現(xiàn)了對(duì)凍害有積極響應(yīng)的TaCBS基因。

滲透脅迫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中游離鈣濃度的瞬時(shí)增加，并且這種鈣離子濃度的急劇變化會(huì)影響下游基因的表達(dá)[26]。已有學(xué)者對(duì)擬南芥中的滲透脅迫相關(guān)基因進(jìn)行了鑒定[27]，發(fā)現(xiàn)一些CBS基因的表達(dá)量發(fā)生改變，在鹽脅迫1 h、6 h和12 h下，CBS基因在根中上調(diào)表達(dá)；而在芽中，這些基因在鹽脅迫1 h和24 h表達(dá)量更高。對(duì)這些基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果表明含有CBS結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可能在干旱、鹽和滲透脅迫中起重要作用。過(guò)氧化物(H2O2)等活性氧(ROS)引起的氧化脅迫是所有需氧生物面臨的挑戰(zhàn)[28-29]，雖然ROS具有一定的毒性，但現(xiàn)在人們普遍認(rèn)為，涉及ROS的氧化還原調(diào)節(jié)是調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)的關(guān)鍵因素[30]。在鹽脅迫下，氧化脅迫誘導(dǎo)CBS基因在根部脅迫3 h時(shí)表達(dá)，而在芽中幾乎所有差異表達(dá)的CBS基因在氧化脅迫下均上調(diào)表達(dá)[10]。最近有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)CBSDUF亞群蛋白DPS1的缺失會(huì)降低小麥的抗氧化活性，導(dǎo)致ROS水平上升，從而導(dǎo)致穗頂端變性，產(chǎn)量降低[31]。本研究發(fā)現(xiàn)雖然在5 ℃低溫下大多數(shù)CBS基因表達(dá)量并沒有明顯的變化(僅一組三聯(lián)體TaCBS-5s以及TaCBS-10B響應(yīng)低溫)，但是在-10 ℃和-25 ℃下，TaTlyc-2s、TaCBS-8s、TaCBSDCBS-1s和TaCBS-10s四組三聯(lián)體表達(dá)量均有明顯的升高。尤其是TaCBS-8s，在4 ℃、5 ℃和-10 ℃都不表達(dá)，但在-25 ℃突然大量表達(dá)。說(shuō)明在-25 ℃時(shí)小麥中ROS大量增加，破壞體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，而CBS蛋白的大量合成可與Trxs結(jié)合，從而啟動(dòng)對(duì)ROS的清除。相對(duì)來(lái)說(shuō)，TaCBS-10s在溫度達(dá)到-10 ℃時(shí)表達(dá)量最高，在-25 ℃略有下降，說(shuō)明它們可能有著較弱的抗寒功能，在-25 ℃時(shí)TaCBS-10s對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)程序不如TaCBS-8s等三聯(lián)體，但是它們啟動(dòng)的更早，說(shuō)明他們對(duì)小麥前期抵御凍害有著很大的幫助。

前人發(fā)現(xiàn)，在小麥中，有70%的三聯(lián)體表達(dá)模式相似[32]。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也發(fā)現(xiàn)大多數(shù)CBS三聯(lián)體有著相似的表達(dá)模式，在CBS家族中有40對(duì)CBS基因三聯(lián)體，約占家族基因總數(shù)的88.24%。說(shuō)明其由二倍體進(jìn)化而來(lái)的保守性較好，但相比于功能性以及保守性強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄因子如TCP(在小麥中擁有66個(gè)，分屬22組三聯(lián)體)[33]保守性略差一些。

總之，鑒于CBS基因的多樣性和重要功能，對(duì)CBS基因家族進(jìn)行系統(tǒng)和詳細(xì)的功能研究十分必要。通過(guò)分析，我們發(fā)現(xiàn)了在小麥抗寒以及發(fā)育中發(fā)揮重要功能的CBS基因，為小麥CBS基因的功能解析奠定了基礎(chǔ)。對(duì)小麥CBS基因家族的研究對(duì)于進(jìn)一步了解多倍體植物的CBS基因特點(diǎn)，并利用基因工程手段提高小麥抗寒性具有重要的理論和實(shí)踐意義。

致謝：感謝東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院付連雙老師提供小麥材料。