宋春華，蒼 晶，于 萍，崔婉琳，張 達(dá)，王多佳，孟 婧，王軍虹

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

小麥作為主要的糧食作物具有很高的營養(yǎng)和研究價值。黑龍江高寒地區(qū)受大陸季風(fēng)性氣候控制，低溫脅迫是限制該地區(qū)種植冬小麥的主要因素。東農(nóng)冬麥1號(Dn1)是首例能在黑龍江高寒地區(qū)安全越冬的冬麥品種(返青率大于85%)，是抗寒研究的珍貴材料[1-2]。因此，開展冬小麥抗寒機制研究對于豐富作物抗寒理論、推動黑龍江高寒地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

研究表明，對初級碳水化合物代謝相關(guān)的基因進(jìn)行遺傳操作是一種具有廣闊前景的作物改良方式[3]?？栁难h(huán)是碳水化合物代謝的基本途徑之一，了解其基因調(diào)控過程，有利于對植物光合作用進(jìn)行有目的地改造。在卡爾文循環(huán)中，磷酸核糖激酶(PRK)在調(diào)節(jié)糖代謝過程中起著關(guān)鍵作用，同時也是負(fù)責(zé)控制同化和再生階段之間平衡的關(guān)鍵酶之一[4]。PRK催化核酮糖1,5-二磷酸(RuBP)再生，為同化CO2提供受體[5]。這種激酶反應(yīng)，是將ATP的g-磷?；D(zhuǎn)移到核酮糖5-磷酸C-1羥基上的唯一途徑，通過該途徑可以重新引導(dǎo)Calvin循環(huán)中間體用于CO2固定[6]。PRK由核基因組編碼并在細(xì)胞質(zhì)中合成，其N-末端具有轉(zhuǎn)運肽的前體蛋白，可以將酶運送到葉綠體[7]。PRK的活性受光、NADP/NADPH比和Mg2+水平的調(diào)節(jié)，同時也可通過PRK/CP12/GAPDH復(fù)合物的可逆解離來調(diào)節(jié)。有關(guān)PRK與植物各種代謝途徑之間的調(diào)控關(guān)系[8-9]，及其時空調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還有待于進(jìn)一步研究。

研究表明，脫落酸(ABA)對植物的光合作用有一定的影響，在穩(wěn)定光合器官及防護(hù)光抑制等方面起著重要的作用[10-11]。外源水楊酸(SA)可提高干旱脅迫下RuBP的活性以及葉綠素的含量，進(jìn)而改善干旱脅迫下作物的生長，增加干物質(zhì)積累量和產(chǎn)量。在植物遭受逆境脅迫(如低溫和鹽堿)時積累大量活性氧(ROS)，噴施外源SA可以增加過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性，進(jìn)而增強清除ROS的能力[12-13]。茉莉酸甲酯(MeJA)同樣參與作物應(yīng)對低溫脅迫的過程，在氧化脅迫中起信號傳遞作用[14-15]。但目前關(guān)于ABA、SA和MeJA參與調(diào)控植物碳同化的研究仍然十分有限，本研究對PRK進(jìn)行了生物信息學(xué)預(yù)測分析，同時通過qRT-PCR分析了寒脅迫下冬小麥PRK基因的表達(dá)模式，進(jìn)而探索TaPRK參與冬小麥響應(yīng)寒脅迫的機制，為豐富冬小麥抗寒理論及選育抗寒新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料：強抗寒冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號(Dn1)(可耐-30 ℃)，在黑龍江地區(qū)返青率≥80%；弱抗寒冬小麥品種濟麥22(J22)，在黑龍江地區(qū)返青率<2%。

于2016年9月13日播種于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田，屬中溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫 3.5 ℃，年平均降雨量約為400～600 mm。小區(qū)面積4 m2(2 m×2 m)，每區(qū)10行，行距為 0.2 m。每行播種150粒，播深5 cm，田間常規(guī)管理[16]。

于三葉期(2016年10月1日)對冬小麥葉片分區(qū)噴施1 mmol·L-1MeJA、1 mmol·L-1SA和10-5mol·L-1ABA，噴灑蒸餾水為對照。大田自然降溫，連續(xù)7 d最低溫度分別達(dá)到5 ℃(2016年10月8日)、0 ℃(2016年10月25日)、-10 ℃(2016年11月9日)和-25 ℃(2017年1月11日)時，分別取樣葉片和分蘗節(jié)，剪成1 cm小段，分別裝袋，用液氮迅速冷凍后置-80 ℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取和實時熒光定量PCR分析

1.2.2 生物信息學(xué)分析

通過NCBI中的Blastp在線工具進(jìn)行其他物種的同源氨基酸序列檢索，使用Clustal X 1.8 和DNAMAN 7.0進(jìn)行氨基酸序列同源比對，用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用在線軟件GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，用ExPASy-ProtParam tool(http://web.exp asy.org/protparam/)軟件分析PRK蛋白的理化性質(zhì)，利用在線預(yù)測軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)分別預(yù)測PRK蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。利用TMHMM Server 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析，利用CELLO v2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)進(jìn)行TaPRK蛋白的亞細(xì)胞定位分析，利用Siqnal P Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)進(jìn)行信號肽預(yù)測，利用Netphos Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)預(yù)測磷酸化位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRK蛋白生物信息學(xué)分析

2.1.1 PRK蛋白的理化性質(zhì)

序列分析表明，冬小麥TaPRK基因與中國春(X51608)一致，含有一個1 215 bp的開放閱讀框，編碼404個氨基酸。經(jīng)ExPASy-ProtParam tool在線預(yù)測分析，PRK蛋白的相對分子質(zhì)量為45.09 kDa，理論等電點(pI)為5.72，是弱酸性蛋白。其不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index)為28.67，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)(<40，蛋白質(zhì)穩(wěn)定)；脂肪族系數(shù)(Aliphatic index)為82.30，總平均親水系數(shù)(Grand average of hydropathicity)為-0.302，表明該蛋白是親水蛋白。該蛋白由20種氨基酸組成，分子式為C2011H3158N540O607S15，含有20個絲氨酸(Serine)磷酸化位點、16個蘇氨酸(Threonies)磷酸化位點和6個酪氨酸(Tyrosines)磷酸化位點。TMHMM Server 2.0和SignalP Server表明，該蛋白無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非分泌蛋白。經(jīng)在線工具CELLO 2.5分析可知，小麥PRK蛋白質(zhì)只存在于葉綠體，并具有一段由52個氨基酸構(gòu)成的葉綠體轉(zhuǎn)運肽。

2.1.2 PRK蛋白質(zhì)的二、三級結(jié)構(gòu)

利用SOPMA在線對PRK蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示，小麥中PRK蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲3種成分組成，分別占總蛋白的33.91%、16.83%和49.26%。預(yù)測結(jié)果表明，PRK蛋白二級結(jié)構(gòu)為mixed型。

為了進(jìn)一步了解PRK的蛋白特性，使用同源建模在線預(yù)測SWISS-MODEL分析系統(tǒng)進(jìn)行三維模型的構(gòu)建，結(jié)果如下：構(gòu)建模板蛋白為5b3f.1.A，PRK與模板的氨基酸序列同源性為91.54%，低聚糖狀態(tài)為同源二聚體，1種配體(4xSO3)，屬于尿苷激酶家族，GMQE(Global Model Quality Estimation)值為0.51，QMEAN值為-3.48。

2.1.3 PRK蛋白質(zhì)多序列比對

經(jīng)過DNAMAN 7.0軟件進(jìn)行多序列比對顯示，小麥PRK蛋白質(zhì)與水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)和二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)的PRK蛋白質(zhì)相似性分別為 92.1%、84.78%和94.8%。在小麥PRK蛋白質(zhì)序列發(fā)現(xiàn)了殘基Cys-52和Ser-53之間轉(zhuǎn)運肽的切割位點，在N-末端發(fā)現(xiàn)了含有52個氨基酸構(gòu)成的葉綠體轉(zhuǎn)運肽，與ATP結(jié)合的保守區(qū)域Cys-68和Cys-107參與小麥PRK蛋白質(zhì)的氧化還原活化，殘基Cys-107也是催化所必需的。His-112和Arg-116這兩個殘基參與了底物核酮糖5-磷酸的結(jié)合(圖1)。

2.1.4 PRK蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用 MEGA 6.0 軟件對小麥與節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschii)、烏拉爾圖小麥(Triticumurartu)、大麥(Hordeumvulgare)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、水稻(Oryzasativa)、狗尾草(Setariaitalica)、玉米(Zeamays)、博落回(Macleayacordata)、黃麻(Corchoruscapsularis)、月季(Rosachinensis)、蓖麻(Ricinuscommunis)、山萮菜(Eutremasalsugineum)、紅車軸草(Trifoliumpratense)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)和大豆(Glycinemax)物種PRK蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果(圖2)表明，TaPRK與AetPRK、TuPRK、HvPRK和BdPRK親緣關(guān)系較近(皆為單子葉禾本科植物)，其中小麥與節(jié)節(jié)麥聚到了一組，烏拉爾圖小麥、大麥和二穗短柄草分別聚為一組，水稻和玉米聚到一組。在雙子葉植物中，擬南芥和山萮菜聚到了一組，而大豆與其他幾種植物的聚類關(guān)系最遠(yuǎn)(圖2)。

圖2 PRK蛋白質(zhì)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.1.5TaPRK基因結(jié)構(gòu)分析

如圖3所示，利用在線軟件GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對小麥、節(jié)節(jié)麥、烏拉爾圖小麥、大麥、二穗短柄草、水稻、狗尾草、玉米、博落回、黃麻、月季、蓖麻、山萮菜、紅車軸草、擬南芥和大豆物種的PRK基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)除二穗短柄草外，均含有5個外顯子和4個內(nèi)含子，基因長度均小于4 000 bp。進(jìn)化樹中大麥、節(jié)節(jié)麥和烏拉爾圖小麥和冬小麥的PRK基因進(jìn)化關(guān)系較近，且具有相似的基因結(jié)構(gòu)和外顯子數(shù)量，保守性較高(皆為單子葉禾本科植物)，其中TaPRK含有5′UTR，TaPRK的5′UTR發(fā)現(xiàn)有調(diào)控元件控制基因表達(dá)的元件啟動子。這些調(diào)控元件可能與TaPRK基因表達(dá)有關(guān)。

圖3 PRK基因結(jié)構(gòu)

2.2 TaPRK在不同冬小麥品種的表達(dá)模式分析

如圖4a所示，在大田自然降溫的條件下，Dn1葉片中TaPRK的相對表達(dá)量隨溫度降低呈現(xiàn)“降-升-降”的變化規(guī)律，-10 ℃時達(dá)到峰值；J22葉片中TaPRK的相對表達(dá)量隨著溫度的降低呈逐漸降低趨勢。Dn1葉片中TaPRK相對表達(dá)量在-10 ℃和-25 ℃時顯著高于J22，而在0 ℃時顯著低于J22葉片中TaPRK的相對表達(dá)量。

如圖4b所示，Dn1和J22分蘗節(jié)中TaPRK的相對表達(dá)量隨著溫度降低呈先增后降趨勢。Dn1分蘗節(jié)中TaPRK的相對表達(dá)量在-10 ℃達(dá)到峰值；J22分蘗節(jié)中TaPRK的相對表達(dá)量在0 ℃達(dá)到峰值，在-10 ℃和-25 ℃趨勢平緩。在整個越冬期間，Dn1分蘗節(jié)中TaPRK相對表達(dá)量都極顯著高于J22。

*和**分別表示兩個品種之間具有顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)差異。圖5同。

2.3 外源ABA、SA和MeJA對Dn1分蘗節(jié)和葉片TaPRK表達(dá)模式的影響

RT-PCR分析外源ABA、SA和MeJA誘導(dǎo)分蘗節(jié)和葉片中TaPRK的表達(dá)模式，結(jié)果顯示，在外源ABA處理下，Dn1葉片中TaPRK的相對表達(dá)量表現(xiàn)為明顯的先增后降趨勢，在-10 ℃達(dá)到峰值，并且顯著高于對照；外源SA處理下，Dn1葉片中TaPRK的相對表達(dá)量呈現(xiàn)“降-升-降”的變化規(guī)律，-10 ℃時顯著高于對照；外源MeJA處理下，Dn1葉片中TaPRK的相對表達(dá)量在5 ℃時與對照組差異不顯著，在0 ℃和-25 ℃時顯著高于對照，在-10 ℃時顯著低于對照，且在0 ℃時TaPRK的相對表達(dá)量達(dá)到峰值(圖5a)。

外源ABA、SA和MeJA處理下，Dn1分蘗節(jié)中TaPRK的相對表達(dá)量均隨著溫度的降低表現(xiàn)為先升后降的趨勢，且均在-10 ℃時達(dá)到峰值。在整個越冬期間，外源ABA和MeJA處理的Dn1分蘗節(jié)中TaPRK的相對表達(dá)量顯著高于對照；在0 ℃和-10 ℃時，外源SA處理Dn1分蘗節(jié)TaPRK的相對表達(dá)量顯著高于對照(圖5b)。

圖5 不同溫度下exo-ABA、SA、MeJA對Dn1葉片(a)和分蘗節(jié)(b)中TaPRK相對表達(dá)量的影響

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)PRK蛋白質(zhì)含有的核酮糖5-磷酸、ATP結(jié)合位點和調(diào)節(jié)TaPRK基因的半胱氨酸殘基與水稻的PRK蛋白質(zhì)相似。TaPRK基因的5′UTR發(fā)現(xiàn)有許多控制基因表達(dá)的元件。這些調(diào)控元件可能與TaPRK基因表達(dá)有關(guān)，但沒有直接證據(jù)證明這些元件調(diào)節(jié)TaPRK基因的表達(dá)。一般來說，TaPRK基因5′UTR的調(diào)節(jié)元件通過與一些轉(zhuǎn)錄因子的相互作用來發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[17]。因此，我們認(rèn)為TaPRK基因可能是研究卡爾文循環(huán)中基因表達(dá)調(diào)控機制的非常好的候選者。

以往研究表明，PRK類轉(zhuǎn)錄因子在植物組織中有表達(dá)差異，如許多在葉片中高量表達(dá)，在莖和花中卻表達(dá)量很少或不表達(dá)[17]。本研究結(jié)果表明，Dn1分蘗節(jié)和葉片中TaPRK的相對表達(dá)量隨著溫度降低呈現(xiàn)不同的趨勢，在-10 ℃表達(dá)量最高，這與實驗室前期證明-10 ℃是Dn1啟動抗寒機制的關(guān)鍵溫度點相一致[16]。而J22分蘗節(jié)和葉片中TaPRK的相對表達(dá)量在0 ℃時達(dá)到峰值，比Dn1提前響應(yīng)低溫脅迫。總體來說，越冬期間Dn1分蘗節(jié)和葉片中TaPRK的相對表達(dá)量明顯高于J22，進(jìn)一步說明強抗寒冬小麥品種Dn1，在越冬期間碳同化效率更高，為積累更多的碳水化合物奠定了基礎(chǔ)，在土壤封凍后葉片和地下莖均有較多的蔗糖和果糖積累，為植物越冬及返青提供重要能量保障[18-20]。

寒冷、干旱、鹽堿和水澇等逆境都會使植物體內(nèi)ABA的含量迅速增加，噴施外源ABA可以刺激葉片內(nèi)源ABA含量增加，從而提高植物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)性[21-22]。劉麗杰等[23]發(fā)現(xiàn)在冬小麥越冬期間噴施外源ABA促進(jìn)了分蘗節(jié)中可溶性糖和淀粉的積累。ABA在植物中參與葡萄糖傳導(dǎo)途徑，ABA的增加會提高相應(yīng)基因的表達(dá)水平及發(fā)育的抑制[24]。本研究結(jié)果表明，外源ABA促進(jìn)低溫(-10 ℃)環(huán)境中Dn1葉片中TaPRK的表達(dá)，呈現(xiàn)正調(diào)控，但在5 ℃和0 ℃時ABA調(diào)控TaPRK的機制并未啟動，這可能是5 ℃和0 ℃時ABA處理過的Dn1幼苗中的TaPRK還未對寒冷做出應(yīng)答。寒脅迫和外源ABA共同作用使冬小麥幼苗中ABA含量增加，促進(jìn)了TaPRK上調(diào)表達(dá)。此外，確定ABA介導(dǎo)的信號通路參與冬小麥響應(yīng)低溫脅迫的機制，以及它們?nèi)绾握{(diào)節(jié)TaPRK基因表達(dá)將是未來工作的一個重要領(lǐng)域。

JA作為一個植物對逆境響應(yīng)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，對植物生長和發(fā)育起著重要作用[25]。它可以促進(jìn)種子萌發(fā)、幼苗生長、葉綠素形成和光合作用過程等。研究發(fā)現(xiàn)外源MeJA可以促進(jìn)光合基因(如rbcS、rbcL、cab和PRK等)的轉(zhuǎn)錄[26-28]。本研究結(jié)果表明，外源MeJA促進(jìn)低溫(0 ℃和-25 ℃)環(huán)境中Dn1葉片中TaPRK的表達(dá)，呈現(xiàn)正調(diào)控，與上述結(jié)果一致，即MeJA處理過的冬小麥幼苗中的TaPRK提前對寒冷做出響應(yīng)。有研究表明，外源SA噴施葉片使葉綠體的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，調(diào)節(jié)氣孔開放程度，進(jìn)而提高植物的光合作用效率，減輕逆境對植物的傷害[20,29-30]。Soliman等[31]研究表明，植物通過調(diào)節(jié)SA變化獲得最佳光合性能，以此來適應(yīng)不斷變化的環(huán)境刺激。本研究表明，外源SA促進(jìn)低溫(-10 ℃)環(huán)境中Dn1葉片中TaPRK的上調(diào)表達(dá)，碳同化效率更高，積累更多的光合產(chǎn)物。

綜上，外源ABA、SA和MeJA通過TaPRK的上調(diào)表達(dá)，在一定程度上減輕低溫脅迫對冬小麥光合作用的抑制，從而提高冬小麥的抗寒性。