李 瑋，宋國琦，李吉虎，李玉蓮，張淑娟，張榮志，高 潔，谷田田，李根英

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東濟南 250100；農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/小麥玉米國家工程實驗室，山東濟南 250100)

小麥銹病(條銹病、葉銹病、稈銹病)和白粉病是全世界流行的小麥真菌性重大病害，可通過空氣遠距離傳播，具有病原菌生理小種復(fù)雜多變、分布廣泛、爆發(fā)性強等特點，大發(fā)生時可造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失[1-4]。多效抗病基因是小麥中發(fā)現(xiàn)的一類寶貴基因資源，在小麥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的多效抗病基因有四個，包括Lr27/Yr30/Sr2[5]、Lr34/Yr18/Pm38/Sr57[6]、Lr46/Yr29/Pm39/Sr58[7]和Lr67/Yr46/Pm46/Sr55[8]，它們對小麥銹病和白粉病同時具有抗性。利用多效抗病基因培育兼抗型品種是防治小麥銹病和白粉病經(jīng)濟有效和環(huán)境友好的途徑。

分子標(biāo)記輔助選擇是分子育種的有效技術(shù)手段，利用分子標(biāo)記對小麥品種品系進行分子檢測是開展分子育種的工作基礎(chǔ)。四個多效抗病基因中Lr34[9]和Lr67[10]已經(jīng)被克隆，其分子標(biāo)記分別為cssfr1～7[11]和TM4、TM10。Sr2被定位在小麥品種Hope3B染色體867 kb的物理區(qū)段內(nèi)，含有34個基因，其中僅有17個與中國春參考基因組中已注釋的基因存在對應(yīng)關(guān)系[12]，CAPS標(biāo)記csSr2[13]位于其中，可用于輔助選擇。Lr46最早被發(fā)現(xiàn)于小麥品種Pavon76中，目前最有效的分子標(biāo)記是csLV46[7,14]，但該基因尚未被克隆。張亞琦[2]報道CAPS標(biāo)記csLV46G22也可用于檢測Lr46。2016年Rasheed[15]開發(fā)了與cssfr5、cssfr7和csSr2對應(yīng)的KASP標(biāo)記Lr34_TCCIND、Lr34jagger和Sr2_ger9 3p。

為了更好地了解多效抗病基因在小麥育種材料中的攜帶情況，本課題組利用目前獲得的最有效的分子標(biāo)記對本團隊收集保存的小麥材料進行檢測分析，并將這些結(jié)果輸入到本課題組開發(fā)的“小麥分子育種信息共享系統(tǒng)”(http://123.232.115.143:8097/Framc/Login.htm)，以期為促進小麥分子標(biāo)記檢測結(jié)果的共享利用和我國小麥抗病分子育種發(fā)展貢獻綿薄之力。

1 材料與方法

1.1 材 料

共檢測小麥品種(系)367份，其中240份為中國農(nóng)科院作物所小麥親本創(chuàng)制與新品種選育團隊提供的來自全世界的遺傳多樣性資源材料，其余127份為本團隊收集的育種親本(大部分來自黃淮冬麥區(qū))。另外，中國春為Lr34的陽性對照，Pavon 76(楚秀生老師提供)為Lr46和Sr2的陽性對照，NP876(蘭彩霞老師提供)為Lr67的陽性對照，濟麥229(李豪圣老師提供)為陰性對照。供試小麥品種(系)于2018年10月5日種植于山東省濟南市試驗基地，利用播種機(Wintersteiger，奧地利)點播，行距33 cm，行長4 m，株距 5 cm，按行長劃排，排間留1 m的田間走道。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

取苗期單株葉片約0.1 g放入2 mL離心管中，加入1個直徑6 mm鋼珠放入液氮中冷凍，然后用SPEX公司Geno/Grinder 2010組織研磨機進行研磨，研磨條件為850 r·min-1，20 s。用天根公司快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)(非離心柱型)提取DNA，加去離子水溶解，調(diào)整DNA濃度約100 ng·μL-1，轉(zhuǎn)移至96孔板保存。

1.2.2 PCR檢測

Lr34和Sr2分別以分子標(biāo)記cssfr5和csSr2進行檢測。由于csSr2原引物組合擴增效果不穩(wěn)定，根據(jù)公布的csSr2所在區(qū)段DNA序列設(shè)計引物Sr2-637R(5′-CCCTGCTATCATCATAATCAGTC-3′)與原引物csSr2F組合進行檢測。PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括5 μL Mix(擎科，青島)，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL(擎科，青島)，DNA 1 μL，去離子水3 μL。采用384孔PCR儀Veriti(AB，美國)進行PCR，PCR反應(yīng)程序為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃或60 ℃ 30 s，35個循環(huán)，72 ℃ 50 s；72 ℃ 3 min。對csSr2的PCR產(chǎn)物進行酶切，酶切體系為10 μL，包括 1 μL 10×緩沖液CutSmart，5 μL PCR產(chǎn)物，0.2 μL BspH Ⅰ(NEB，北京)和3.8 μL去離子水，37 ℃孵育20 min。PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物用GoldView Ⅱ型(索萊寶，北京)染色，用1.5%或2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，Marker為DL2000(擎科，北京)，采用Universal Hood Ⅱ(伯樂，美國)拍照。

1.2.3 KASP檢測

對cssfr5檢測Lr34為陽性的材料進一步用KASP標(biāo)記Lr34jagger檢測是否存在Jagger類型變異。Lr46和Lr67分別以Lr46_JF2-2和TM10進行檢測。KASP反應(yīng)體系為5 μL，包括2.5 μL Master Mix(LGC，北京)，10 μmol·L-1引物混合0.3 μL(KASP有3條引物，按C∶F∶H=5∶2∶2比例混合，其中C為共用引物，F(xiàn)為Fam類型位點特異引物，H為Hex類型位點特異引物)(Invitrogen，北京)，DNA 1 μL，去離子水1.2 μL。反應(yīng)程序參考KASP標(biāo)準(zhǔn)程序，僅Touchdown起始溫度設(shè)為65 ℃，每個循環(huán)下降 0.8 ℃。用PHERAstar(LGC，英國)KASP熒光檢測儀進行檢測，用KlusterCaller軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多效抗病基因檢測結(jié)果

cssfr5是由兩個顯性標(biāo)記組合而成的共顯性標(biāo)記，但是兩個標(biāo)記之間存在相互干擾的現(xiàn)象，因此實驗中對其分開檢測。在Lr34出陽性材料中，利用引物L(fēng)34SPF和L34DINT13R2組合可以在樣品DNA中擴增出751 bp的片段(圖1)；在Lr34陰性材料中，利用引物L(fēng)34DINT9F和L34MINUSR組合可以在Lr34陰性樣品的DNA中擴增出523 bp的片段(圖2)。對cssfr5檢測為陽性的材料進一步用 Lr34jagger檢測是否存在基因提前終止變異(Jagger類型)，如果檢測結(jié)果為Hex類型(紅色)，則對應(yīng)基因存在提前終止變異，材料中Lr34為陽性；如果檢測結(jié)果為Fam類型(藍色)，則對應(yīng)基因無提前終止變異，材料中Lr34為陰性(圖3)。

圖3 Lr34 Jagger檢測結(jié)果

圖2 部分材料的 Lr34陰性標(biāo)記檢測結(jié)果

M：DL2000；CK：中國春；1：河農(nóng)5480；2：汶農(nóng)19；3：JNM3070；4：濟麥262；5：邢麥13號；6：京雙16；7：975106；8：山融3號。圖2同。

在含有Sr2的材料中，使用scSr2標(biāo)記對應(yīng)的引物可在其DNA中擴增出484 bp的片段(圖4)，酶切后可得到317 bp、114 bp和53 bp的條帶，在不含Sr2的材料中，同樣的引物在樣品，DNA中無擴增片段，或者擴增片段酶切后得到370 bp和114 bp的條帶。實驗中，53 bp的片段在酶切和電泳過程中會變?nèi)趸蛳?，可根?jù)317 bp和370 bp的條帶差異來判斷是否含有Sr2(圖5)。

M：DL2000；CK：Pavon76；1：泰山6436；2：和尚頭；3：BFB10；4：中麥23；5：齊麥2號；6：煙1212；7：煙農(nóng)578；8：濟麥229。圖5同。

圖5 部分材料的csSr2酶切結(jié)果

利用KASP標(biāo)記Lr46_JF2-2對材料樣本進行檢測，若檢測結(jié)果為Hex類型(紅色)，則材料中Lr46為陽性；若檢測結(jié)果為Fam類型(藍色)，則材料中Lr46為陰性(圖6)。與Lr34和Sr2的檢測結(jié)果相比，Lr46的檢測結(jié)果存在假陽性，因此結(jié)果中陽性率很高(csLV46G22的陽性率更高，所以本研究未采用)。采用KASP標(biāo)記TM10對材料進行檢測，若檢測結(jié)果為Hex類型(紅色)，則材料中Lr67為陰性；若檢測結(jié)果為Fam類型(藍色)，則材料中Lr67為陽性(圖7)。

圖6 Lr46檢測結(jié)果

圖7 Lr67檢測結(jié)果

對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)共有174樣次多效抗病基因的分子標(biāo)記檢測結(jié)果為陽性，其中含有Lr34的材料有23份(26份cssfr5陽性，其中3份為基因存在提前終止變異的Jagger類型)，含有Sr2的有12份；含有Lr46的有138份；僅在對照品種NP876中檢測到Lr67，表明Lr67在國內(nèi)外材料中被利用均較少。

2.2 品種(系)攜帶多效抗病基因情況

在檢測的367份小麥材料中，不含多效抗病基因的材料有203份，占檢測總數(shù)的55.31%；含有一個多效抗病基因的有155份，占檢測總數(shù)的42.23%；含有兩個多效抗病基因的有8份，占檢測總數(shù)的2.18%；含有三個多效抗病基因的僅有1份，占檢測總數(shù)的0.27%，表明同時利用多個多效抗病基因的品種(系)較少。

在攜帶一個多效抗病基因的155份品種(系)中，17份材料含有Lr34，分別是BRUTA、DONSKI-93、F498U1-1021/BOEMA、F92080G1-1/F93042G2-1、F98047G14-2INC、HK1、Kanto 107、MV05-08、ProINTA Colibr 1、Salmone、和尚頭、淮麥21、山融3號、陜512、洋小麥、中國春、周麥13；8份材料含有Sr2，分別是Dorico、Kitanokaori、淮麥20、濟南13、濟寧16、魯麥21、齊麥2號、周麥25；129份材料含有Lr46，分別是11CA40、3D232、Aca 601、Aztec、Blu99603、C39、CA0816-R、CA0816-W、CA0958、CA0998、CA1062、CA1119、CA1133、CA1135、CA9722、Carimulti、E、Fr03717、Fr03725、Fr03732、Fr03733、Fr3713、Genio、Insignia、Jagger/W94-244-132、K03566、Klein Flecha、Klein Jabal 1、LASEN、Libero、LS4695、Manital、Mantol、Mesofold、Nidera Baguette 10、PH82-2、Sagittario、Sunstate、北京841、藁城8901、藁優(yōu)5218、藁優(yōu)5766、觀35、河農(nóng)5480、河農(nóng)7069、菏麥0662、菏麥20、衡7228、衡觀33、衡觀35、濟麥262、濟南17、冀麥181、冀師02-1、金麥1號、晉麥45、晉麥61、晉麥67、京411、京9428、京冬17、京冬22、京冬8號、京雙16、京雙16、臨抗12、臨麥2號、臨麥4號、臨麥6號、臨麥8號、臨選5186、臨優(yōu)145、臨優(yōu)359、臨遠3158、臨遠6521、魯麥11、魯麥23、魯麥5號、魯麥7號、魯麥8號、輪選987、內(nèi)鄉(xiāng)188、農(nóng)大211、農(nóng)大212、濮興5號、秦農(nóng)151、秦農(nóng)731、儒麥1號、陜229、陜253、陜715、陜農(nóng)78-59、陜農(nóng)981、石新733、石新828、泰農(nóng)1014、泰山22、泰山23、泰山23號、泰山6436、皖麥33、皖麥38、汶農(nóng)17、汶農(nóng)6號、西農(nóng)2000-7、西農(nóng)88、小偃6、小偃81、新18391、新麥26、新麥37、新麥9號、煙85771、煙農(nóng)15、永4896、豫麥18、豫麥47、豫麥49、豫麥57、鄭麥366、中麥175、中麥23、中麥415、中優(yōu)206、中優(yōu)335、中優(yōu)9507、周8425B、周麥12和周麥23。

在攜帶兩個以上多效抗病基因的9份品種(系)中，6份為國外材料，3份為中國材料。其中，鄭麥9023、西農(nóng)1376和對照品種Pavon76含有Sr2和Lr46；TX03A0148、lasen、MV LAURA、Mason/Jagger和德抗961含有Lr34和Lr46；僅Aca 801含有Lr34、Sr2和Lr46三個基因。

3 討 論

多效抗病基因除了兼抗銹病(條銹病、葉銹病和稈銹病)和白粉病的優(yōu)點外，還具有抗病譜廣、抗病性持久等特點。Mcfadden[16]在1930年就報道了含有Sr2的小麥品種Hope具有良好的稈銹病抗性，1976年小麥Pavon76在墨西哥審定，Singh等[17]發(fā)現(xiàn)其含有Lr46；1977年Dyck在中國引入加拿大的材料PI58548中發(fā)現(xiàn)了Lr34[18-19]，1979年Dyck[20]在巴基斯坦小麥PI250413中發(fā)現(xiàn)一個成株抗葉銹基因，后被命名為Lr67。這四個基因從發(fā)現(xiàn)至今已有40～90年，在生產(chǎn)上仍具有較好抗性。但在本研究的檢測結(jié)果中，攜帶Lr34的材料僅有26份，攜帶Sr2的材料僅有12份，而同時攜帶兩個以上多效抗病基因的中國材料僅有3份，這與前人的檢測結(jié)果基本一致。

導(dǎo)致這種現(xiàn)狀的原因可能是多效抗病基因?qū)儆诔芍昕剐?，在苗期抗病性較差甚至表現(xiàn)為感病而且單個基因的作用較小，在常規(guī)育種過程中容易丟失，所以在現(xiàn)有的品種(系)中，檢測到同時攜帶多個多效抗病基因的材料較少。在常規(guī)育種過程中以分子標(biāo)記進行輔助選擇是利用多效抗病基因行之有效的方法。目前Sr2和Lr46基因還未被克隆，只有連鎖標(biāo)記可以用。Sr2的緊密連鎖標(biāo)記csSr2距離基因很近，可以用于輔助選擇，不過Sr2基因位點在大多數(shù)小麥材料中存在大片段缺失，即不能利用PCR對csSr2片斷進行擴增，csSr2在生產(chǎn)上多數(shù)是顯性標(biāo)記，在育種后代無法區(qū)分雜合子和純合子。利用KASP標(biāo)記Lr46_JF2-2對基因Lr46檢測時，盡管存在假陽性結(jié)果，但如果雜交組合的親本存在多態(tài)性仍然可以用于輔助選擇，這種情況也適用于另一個分子標(biāo)記csLV46G22。功能標(biāo)記(functional marker)是功能基因克隆之后根據(jù)等位基因變異開發(fā)的分子標(biāo)記[21]，在抗病育種過程中利用Lr34和Lr67的功能標(biāo)記進行選擇，可省去抗病鑒定環(huán)節(jié)，做到事半功倍。

根據(jù)已報道[15]的結(jié)果Lr34_TCCIND和Sr2_ger9 3p這兩個KASP標(biāo)記檢測結(jié)果較好，但本研究依據(jù)這兩個分子標(biāo)記進行檢測，結(jié)果無法進行分型，且大量測試實驗后效果一直沒有得到改善。此外，cssfr5和csSr2這兩個標(biāo)記檢測效果不穩(wěn)定，以致于后期效果變差甚至無法擴增，將cssfr5拆開檢測，并且重新設(shè)計csSr2引物才解決此問題。因此在開發(fā)分子標(biāo)記時，可以針對同一個基因開發(fā)多個分子標(biāo)記或多種類型的分子標(biāo)記。多個分子標(biāo)記可以在一個標(biāo)記效果不好時有其他標(biāo)記可以替代，多種類型的分子標(biāo)記可以降低使用門檻。例如現(xiàn)在SNP標(biāo)記一般都設(shè)計成KASP標(biāo)記，但對于沒有KASP檢測設(shè)備的單位(比如地市級農(nóng)科院所和中小型育種公司)就無法進行KASP檢測，如果同時開發(fā)為dCAPS標(biāo)記，就可以為分子標(biāo)記在育種中的應(yīng)用提供便利 條件。

Lr34是第一個被克隆的多效抗病基因，后續(xù)研究表明Lr34可以增強其他多效抗病基因的抗性[22-23]，在Lr34轉(zhuǎn)基因的水稻[24]、大麥[25-26]、硬粒小麥[27]、玉米[28]和高粱[29]中對多種病害均具有抗病性?？梢姸嘈Э共』蜃鳛橐活惇毺氐幕蛸Y源具有巨大的應(yīng)用價值和廣闊的利用空間。Lr67為第二個被克隆的多效抗病基因，對種質(zhì)材料的分子標(biāo)記檢測結(jié)果表明，該基因在小麥品種(系)中的分布極少，在被檢測的中國材料中僅在三個地方品種(品種名稱已經(jīng)不可考)中檢測到[10]，本研究的檢測結(jié)果也證實了這一點。因此在育種過程中利用分子標(biāo)記輔助選擇聚合多個多效抗病基因，同時增加對Lr67的利用將有利于我國對小麥生產(chǎn)中銹病和白粉的防控。為方便科研人員了解小麥已開發(fā)的分子標(biāo)記，掌握親本材料的分子標(biāo)記檢測結(jié)果，我們開發(fā)了“小麥分子育種信息共享系統(tǒng)”，收錄了部分公開發(fā)表的分子標(biāo)記和檢測結(jié)果，只需要簡單注冊就可以登錄查看，本研究結(jié)果也將在整理后導(dǎo)入該系統(tǒng)。歡迎各位同行與我們聯(lián)系，在“小麥分子育種信息共享系統(tǒng)”中分享數(shù)據(jù)，共贏互惠。