范興懇 鐘炳圖 陳學(xué)秀 徐曉微 柳會(huì)瓊 黃兆浪

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬蒼南醫(yī)院，浙江 溫州 325800；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江溫州 325000）

百草枯（PQ）中毒以口服為主要途徑，是目前急診科最常見的中毒急危重癥。人口服PQ致死量為30～40 mg/kg，病死率可達(dá)50%～70%［1］之上。本研究為了探討桃仁承氣湯對(duì)PQ中毒引起的大鼠肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，應(yīng)用桃仁承氣湯治療大鼠PQ中毒肺損傷模型，觀察大鼠生存曲線和肺組織病理改變，檢測(cè)后細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)、炎癥因子水平等變化，以期為桃仁承氣湯治療PQ中毒肺損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠80只。體質(zhì)量200～250 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（浙）2018-103。本研究動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 桃仁承氣湯（大黃15 g，芒硝6 g，桃仁9 g，當(dāng)歸9 g，白芍9 g，牡丹皮9 g，浙江宇晨中藥飲片有限公司）。PQ溶液（美國先正達(dá)）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、高遷移族蛋白（HMGB1）等ELISA檢測(cè)試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.3 造模與給藥 實(shí)驗(yàn)前8 h禁食、4 h禁水。按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、桃仁承氣湯對(duì)照組、PQ模型組和桃仁承氣湯治療組，每組10只。灌胃染毒給藥：桃仁承氣湯治療組和PQ模型組予25%百草枯溶液灌胃染毒（100 mg/kg）；空白對(duì)照組灌胃0.9%氯化鈉注射液40 mL/kg。桃仁承氣湯治療組染毒后3、9、24、48 h予桃仁承氣湯灌胃（5.13 g/kg）；空白對(duì)照組和PQ模型組予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃；桃仁承氣湯對(duì)照組3、9、24、48 h予桃仁承氣湯灌胃。

1.4 觀察大鼠一般狀況及生存曲線 實(shí)驗(yàn)從飼養(yǎng)開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每小時(shí)觀察大鼠精神狀況、體表、活動(dòng)、飲水進(jìn)食情況，并密切觀察大鼠的二便情況；每半小時(shí)觀察各組大鼠死亡數(shù)，記錄染毒后72 h各組死亡數(shù)，計(jì)算各組大鼠存活率。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）血標(biāo)本的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)72 h后經(jīng)股動(dòng)脈采血，用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)大鼠血清TNF-α、IL-6、SOD、MDA、HMGB1的變化。2）肺干/濕重比（D/W）。采血后立即開胸取左肺精確稱重，烘烤至恒重，稱其干質(zhì)量，計(jì)算D/W比值。3）肺組織病理學(xué)觀察。取部分右肺組織，行HE染色，光鏡下觀察肺組織病理變化，并進(jìn)行病理評(píng)分；評(píng)分項(xiàng)目包括水腫、充血、中性粒細(xì)胞浸潤、支氣管內(nèi)出血和碎屑、細(xì)胞增生，每項(xiàng)的評(píng)分按損傷程度分為0、1、2和3分，取5項(xiàng)評(píng)分總和。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，生存曲線用Log Rank Test分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀況及存活率的比較 見表1。與空白對(duì)照組大鼠比較，PQ模型組大鼠一般狀況明顯變差；桃仁承氣湯治療組除大便次數(shù)多、軟，一般狀況較PQ模型組好轉(zhuǎn)。PQ模型組大鼠中毒后72 h存活率為60%，桃仁承氣湯治療組同時(shí)間點(diǎn)存活率為90%，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。空白對(duì)照組及桃仁承氣湯對(duì)照組大鼠存活率均為100%。

表1 各組大鼠存活率比較（n）

2.2 各組大鼠肺D/W和病理學(xué)指標(biāo)的比較 見表2。與空白對(duì)照組比較，PQ模型組肺D/W明顯下降（P<0.05）；與PQ模型組比較，桃仁承氣湯治療組肺D/W值顯著下降（P<0.05）。病理組織評(píng)分：與空白對(duì)照組比較，PQ模型組大鼠肺病理組織評(píng)分明顯升高（P<0.05）；與PQ模型組比較，桃仁承氣湯治療組大鼠的肺病理組織評(píng)分下降（P<0.05）。

表2 各組大鼠肺組織干濕重比和病理學(xué)評(píng)分比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織干濕重比和病理學(xué)評(píng)分比較（±s）

與空白對(duì)照組比較，?P<0.05

組 別 肺病理學(xué)評(píng)分（分）n 肺D/W空白對(duì)照組桃仁承氣湯對(duì)照組PQ模型組桃仁承氣湯治療組0.750±0.463 0.875±0.344 14.87±0.354*12.75±1.389△10 10 10 10 0.228±0.004 0.225±0.009 0.206±0.011*0.164±0.005△

2.3 各組光鏡下大鼠肺組織病理學(xué)比較 見圖1。光鏡下空白對(duì)照組和桃仁承氣湯對(duì)照組的肺臟組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔無水腫、炎癥，肺泡腔清晰，PQ模型組大鼠大部分肺泡腔內(nèi)可見滲出、水腫、出血，肺間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤，而桃仁承氣湯治療組大鼠上述病變減輕。

2.4 各組炎癥因子水平比較 見表3。與空白對(duì)照組比較，PQ模型組TNF-α、IL-6水平明顯升高，桃仁承氣湯治療組大鼠TNF-α、IL-6水平則較PQ模型組明顯下降（P<0.05）。與空白對(duì)照組比較，PQ模型組HMGB1水平明顯升高，而桃仁承氣湯治療組大鼠HMGB1水平則較PQ模型組明顯下降（P<0.05）。

圖1 各組光鏡下大鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE染色，200倍）

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平比較（pg/mL，±s）

組別空白對(duì)照組桃仁承氣湯對(duì)照組PQ模型組桃仁承氣湯治療組n 10 10 10 10 TNF-α 21.43±1.902 23.66±4.171 27.35±3.462*21.42±4.475△IL-6 61.56±9.469 73.12±17.82 140.3±27.46*113.2±16.39△HMGB1 14.76±1.363 17.98±2.634 33.21±6.611*25.41±7.097△

2.5 各組氧化應(yīng)激因子水平比較 見表4。與空白對(duì)照組比較，PQ模型組SOD水平明顯下降，MDA明顯升高（P<0.05）；與PQ模型組比較，桃仁承氣湯治療組大鼠SOD水平明顯升高，MDA水平明顯下降（P<0.05）。

表4 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較（±s）

表4 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較（±s）

組別空白對(duì)照組桃仁承氣湯對(duì)照組PQ模型組桃仁承氣湯治療組n 10 10 10 10 SOD（ng/mL）1.200±0.0088 1.324±0.1594 0.667±0.1819*1.233±0.3307△MDA（nmol/mL）0.3973±0.0784 0.4321±0.1423 0.6677±0.1598*0.3612±0.1682△

3 討 論

PQ致死率高，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，救治困難。目前臨床上對(duì)PQ中毒導(dǎo)致的損傷治療并無特異的治療藥物［2-3］。本團(tuán)隊(duì)研究一系列在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)能降低PQ中毒的藥物如：Betanin［4］、二巰丙磺鈉［5］、血必凈注射液［6］、烏司他丁［7］等，這些藥物大多減輕動(dòng)物體內(nèi)氧化損傷、降低炎癥因子水平，可改善受損臟器的功能，但臨床上效果不理想。因此，尋找能提高PQ急性中毒解毒療效藥物，降低死亡率具有重大的意義。中醫(yī)藥治療PQ中毒肺損傷方面的文獻(xiàn)記載較少，尤其是經(jīng)方。桃仁承氣湯見載于《溫病條辨》?！稖夭l辨·下焦篇》第21條云“少腹堅(jiān)滿，小便自利，夜熱早涼，大便閉，脈沉實(shí)者，蓄血也。桃仁承氣湯主之”。本方由大黃、芒硝、桃仁、當(dāng)歸、白芍、牡丹皮組成，功擅瀉熱通腑，活血化瘀。有文獻(xiàn)報(bào)道，桃仁承氣湯能升高ALI/ARDS大鼠SOD水平，降低TNF-α、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等水平，并且減輕肺間質(zhì)及肺泡炎性細(xì)胞的浸潤、滲出和積聚，改善肺水腫與肺瘀血，有一定的肺保護(hù)作用［8-9］。

PQ致肺損傷在臨床上主要表現(xiàn)為咳嗽、喘憋、胸悶、呼吸頻率加快（氣促），甚至口唇發(fā)紺，多伴有腸鳴音減弱、腹脹便秘等。其基本的病理特點(diǎn)在于肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞廣泛受損，血管通透性增強(qiáng)引起肺間質(zhì)和肺泡水腫，肺內(nèi)開放的血管減少形成微血栓，導(dǎo)致肺內(nèi)微循環(huán)障礙。中醫(yī)文獻(xiàn)中雖無此類病的記載，但根據(jù)其臨床所表現(xiàn)的呼吸窘迫、口唇發(fā)紺、腹部脹滿、大便秘結(jié)等特點(diǎn)，可將之歸于“暴喘”“喘脫”和“腑實(shí)”“結(jié)胸”等范疇［10］，晚期屬于“肺痿”范疇。早期本病病機(jī)多屬邪毒內(nèi)滯腸胃，肺失宣降，肺氣上逆，氣滯血瘀；晚期本病病機(jī)多屬肺葉瘺廢，腎不納氣［11］。針對(duì)PQ肺損傷的病因及臨床表現(xiàn)，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為邪毒從口而入，雖經(jīng)洗胃，但仍有PQ潴留胃腸，熱毒壅滯，肺與腸相表里，腸病及肺，肺腸同病，故中醫(yī)學(xué)從整體觀念的理論出發(fā)，認(rèn)為“肺與大腸相表里”是PQ肺損傷發(fā)病機(jī)制之一或密切相關(guān)?！胺闻c大腸相表里”理論早已在中醫(yī)學(xué)記載，現(xiàn)代學(xué)者對(duì)其理論內(nèi)涵和臨床應(yīng)用已有許多方面的研究，成果頗豐?，F(xiàn)代研究認(rèn)為肺與大腸在生理、病理信息表達(dá)上存在共振現(xiàn)象：信息通路傳導(dǎo)、微生物菌群協(xié)調(diào)、相同黏膜免疫機(jī)制、特殊分子表達(dá)、胚胎早期同源性。肺與大腸相表里理論臨床應(yīng)用廣泛，主要是腸病治肺、肺病治腸、肺腸同治等。但在PQ中毒肺損傷中的應(yīng)用目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。筆者在“肺與大腸相表里”理論指導(dǎo)下，應(yīng)用桃仁承氣湯使PQ瀉下而逐瘀，通腑氣以利肺氣，利肺氣以助血行，從而發(fā)揮肺主治節(jié)的功能［12］，待進(jìn)一步驗(yàn)證。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們制作了大鼠PQ灌胃中毒急性肺損傷模型，探討了桃仁承氣湯對(duì)PQ中毒引起的大鼠肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，分別在分子及蛋白水平、病理學(xué)等檢測(cè)了炎癥因子、氧化應(yīng)激等相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示：桃仁承氣湯對(duì)PQ染毒大鼠肺的炎癥反應(yīng)因子、氧化應(yīng)激水平有影響；對(duì)肺組織病理學(xué)改變方面有影響；桃仁承氣湯對(duì)中毒大鼠一般狀況、生存時(shí)間有影響。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體分析如下：與PQ模型組比較，桃仁承氣湯治療組HMGB1水平及MDA含量相對(duì)降低，SOD活力相對(duì)升高，IL-6及TNF-α的水平也相對(duì)降低。從光鏡下和病理學(xué)評(píng)分可以看出，桃仁承氣湯能明顯改善PQ對(duì)肺組織的病理損傷；生存時(shí)間、生存率較PQ組明顯提高，可以推論桃仁承氣湯能延長PQ中毒急性肺損傷大鼠的生存時(shí)間。在抗氧化應(yīng)激的方面，桃仁承氣湯能抑制MDA的活性，提高SOD的活性，從而發(fā)揮了抗氧化應(yīng)激作用；炎癥因子水平檢測(cè)結(jié)果提示桃仁承氣湯能抑制IL-6、TNF-α、HMGB1等炎癥因子的釋放。姚永明等［13］認(rèn)為HMGB1可分泌到細(xì)胞外，可與TNF-α、IL-6等重要炎癥因子相互誘生。循環(huán)HMGB1在膿毒癥后期升高，有可能作為一種晚期炎癥介質(zhì)參與膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展過程［14］。HMGB1被認(rèn)為既是炎癥早期的啟動(dòng)者，又是炎癥晚期的促進(jìn)者［15］。炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡與自噬等都可能參與到ALI的發(fā)生發(fā)展過程中，而這些病理變化之間又有千絲萬縷的關(guān)系，相互交錯(cuò)，構(gòu)成復(fù)雜性網(wǎng)絡(luò)，共同作用［16-17］。桃仁承氣湯的瀉下逐瘀、通腑利肺、肺主治節(jié)功效主治原則在PQ中毒大鼠肺損傷炎癥反應(yīng)調(diào)控和信號(hào)通路機(jī)制中有體現(xiàn)［18-20］?？傊?，桃仁承氣湯可能通過抑制HMGB1及其與IL-6、TNF-α等炎癥因子相互誘生和通過抑制MDA、提高SOD活力從而實(shí)現(xiàn)對(duì)PQ中毒大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用。