郭雙元，任惠文，張艷琴，馮傳欣，馮 浩，王曉杰，康振生，張新梅

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，陜西楊凌712100； 2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，陜西楊凌712100)

轉(zhuǎn)錄因子在生物和非生物脅迫信號通路中發(fā)揮重要作用[1]。堿性亮氨酸拉鏈蛋白(basic leucine zipper，bZIP)是真核生物轉(zhuǎn)錄因子中最大、最保守的類型之一[2]，不僅參與植物的生長發(fā)育過程，也參與生物和非生物脅迫的響應(yīng)，如干旱、高鹽、高滲以及病原菌的防御[3-4]。水楊酸(SA)作為一種植物激素，是引起系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)的免疫信號。病程相關(guān)基因非表達子(non-expressor of pathogenesis-related genes 1，NPR1)在擬南芥突變體篩選中首次被發(fā)現(xiàn)，是SA的受體，與SA有很高的親和力[5]。病原菌侵染植物后，植物體內(nèi)的SA含量會迅速提高，同時以多聚體形式存在的NPR1蛋白會轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩锘钚缘膯误w形式，并轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi)與bZIP類轉(zhuǎn)錄因子中的TGA亞家族相互作用，從而調(diào)節(jié)防御基因的表達，提高植物的抗病能力[6-7]。AtTGA2、AtTGA3和AtTGA5是擬南芥bZIP 轉(zhuǎn)錄因子TGA/OBF亞家族中的三個成員，研究發(fā)現(xiàn)這三個成員均和NPR1緊密結(jié)合[8-10]。煙草TGA2.1/TGA2.2及水稻TGA2.1/TGA2.2/TGA2.3等多個TGA轉(zhuǎn)錄因子也均能與擬南芥NPR1相互作用，說明在不同物種間NPR1-TGA間的相互作用是高度保守的[9-10]。

目前，小麥中bZIP轉(zhuǎn)錄因子已被廣泛研究，如在擬南芥中過表達TabZIP基因可增強對鹽、干旱、高溫和氧化脅迫的耐受力[2]；過表達TabZIP174基因可提高擬南芥種子萌發(fā)率，且參與植物對干旱脅迫的調(diào)節(jié)[11]。此外，在小麥條銹病菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritici，Pst)的脅迫下，抗病植株中SA受體TabZIP在非親和組合中被快速誘導(dǎo)表達，表現(xiàn)為正調(diào)節(jié)作用[7]。而易感病小麥在接種赤霉菌后，bZIP 超級家族蛋白Ta_S12983212表現(xiàn)出明顯的負調(diào)節(jié)作用[12]。以上研究結(jié)果均表明，bZIP轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)生物及非生物脅迫方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。

bZIP轉(zhuǎn)錄因子在小麥響應(yīng)條銹菌脅迫的調(diào)控過程中起著至關(guān)重要的作用，但目前具體的機理尚不明確。本研究通過篩選小麥-條銹菌互作的小麥cDNA文庫，得到了一個編碼bZIP類轉(zhuǎn)錄因子的TaTGA2.2基因，并利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析了條銹菌、激素和非生物脅迫處理后小麥TaTGA2.2基因的表達變化。在此基礎(chǔ)上，本研究運用酵母系統(tǒng)驗證 TaTGA2.2的轉(zhuǎn)錄激活活性，在擬南芥原生質(zhì)體中進行TaTGA2.2的亞細胞定位，以及利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(VIGS)初步分析TaTGA2.2基因在小麥與條銹菌互作過程中的功能，以期深入解析小麥與條銹菌互作的分子機理，為合理選育及利用抗病品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥品種為水源 11，小麥條銹菌為非親和生理小種CYR23和親和生理小種CYR31。均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院提供。

將小麥播種后于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度 16 ℃，光照強度 6 000 lx，光照時間 14 h)，待幼苗長至一葉一心期，參照康振生等[13]的方法接種條銹菌，分別采集0、12、24、48、72和 120 h 的小麥葉片用液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

激素處理：對一葉一心期的小麥幼苗分別噴施溶于0.1%(v/v)乙醇的2 mM的水楊酸(SA)，100 mM的茉莉酮酸酯(JA)，100 mM的乙烯(ET)以及100 mM的脫落酸(ABA)，噴施0.1%(v/v)乙醇作為對照[14]，分別采集0、2、6、12、24和48 h樣品于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

非生物脅迫處理：小麥幼苗根部浸泡在20% PEG 4000以及200 mM NaCl的水溶液中分別進行干旱和高鹽處理；用無菌的刀片劃傷葉片進行傷處理；小麥幼苗放置在12 h光周期的生長室進行4 ℃低溫處理，樣品分別在處理0、2、6、12和24 h后采取并存放于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA 的提取與 cDNA 的合成

采用 Biozol 試劑(BioFlux)提取各個取樣時間點接種條銹菌的小麥葉片總RNA，cDNA第一鏈的合成按照Invitrogen公司的M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒操作說明書進行，反轉(zhuǎn)錄引物采用oligod(T)18。

1.3 TaTGA2.2基因的克隆

從本實驗室構(gòu)建的水源 11與條銹菌CYR23以及CYR31互作的小麥cDNA文庫，從中篩選小麥TaTGA2.2基因的EST序列，并結(jié)合實驗室現(xiàn)有的數(shù)據(jù)和NCBI等公共數(shù)據(jù)庫，通過電子克隆得到目標序列。利用軟件Primer Premier 5.0在序列兩端設(shè)計擴增引物TaTGA2.2-F/TaTGA2.2-R(表1)。以1.2中反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增體系(40 μL)為： Prime STAR Max DNA Polymerase(Takara，Dalian，China)20 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 17 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，36個循環(huán)；72 ℃延伸 6 min，16 ℃保存。目標基因膠回收后將其克隆到T-Simple載體上，并進行雙向測序。

M：DL2000 標準分子量DNA；P：PCR擴增產(chǎn)物。

1.4 序列分析

將克隆得到的測序序列在NCBI網(wǎng)站上運用BLAST搜索工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對NR(Non-Redundant)數(shù)據(jù)庫進行搜索，進行同源性分析；用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)進行開放閱讀框查找；用Premier 5.0將ORF序列翻譯成氨基酸序列；使用InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域或功能域；使用DNAMAN對目的基因氨基酸序列與其他植物的TGA家族轉(zhuǎn)錄因子進行序列比對；運用MEGA 5.1軟件構(gòu)建TaTGA2.2與其他bZIP家族成員的系統(tǒng)進化樹。

1.5 表達模式分析

根據(jù)TaTGA2.2序列設(shè)計特異定量引物，選擇小麥延伸因子TaEF-1α(GenBank accession number:Q03033)作為內(nèi)參基因，具體引物序列參照表1。以合成的各個處理樣品的cDNA為模板，使用定量儀Bio-Rad CFX96進行實時定量PCR分析。實時熒光定量PCR參照 Guo等[15]的方法。每個處理進行3次生物學(xué)重復(fù)，根據(jù)Ct值求平均值，利用2-△△Ct法[16]計算目標基因的相對表達量。

1.6 亞細胞定位

構(gòu)建TaTGA2.2與GFP融合表達載體：根據(jù)p16318hGFP表達載體的圖譜以及TaTGA2.2基因序列選擇Hind III、BamH I酶切位點，利用Primer Premier 5.0設(shè)計擴增去掉終止密碼子的ORF序列的引物，并在上、下游引物上分別引進Hind III、BamH I酶切位點(引物序列參見附表1)。以cDNA為模板，對目的基因進行片段擴增，將正確的擴增片段進行回收和載體構(gòu)建，然后對構(gòu)建好的載體進行測序驗證。使用Hind III和BamH I對測序正確的載體以及p16318hGFP載體進行雙酶切，分別回收目的產(chǎn)物。將目的基因回收產(chǎn)物以及載體回收產(chǎn)物使用T4 DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并送測序。

將構(gòu)建成功的融合載體轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體進行瞬時表達分析，觀察TaTGA2.2在細胞中的定位情況。原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化方法參照Ahmed等[17]的方法。

1.7 酵母自激活驗證

本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，通過InterProScan保守結(jié)構(gòu)域分析，推測TaTGA2.2的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域位于N端前46個氨基酸。為了驗證此推測，本研究根據(jù)TaTGA2.2基因序列設(shè)計引物，并引進NdeI和BamH I 限制性酶切位點(引物序列參見表1)，將截去N端1～46個氨基酸的TaTGA2.247-334以及TaTGA2.2全長TaTGA2.21-334構(gòu)建到酵母表達載體pGBKT7 上(具體方法同1.6)，獲得pGBKT7-TaTGA 2.247-334和pGBKT7-TaTGA2.21-334重組質(zhì)粒。將獲得的重組質(zhì)粒以及陰性對照pGBKT7空載體分別轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109中(上海唯地生物技術(shù)有限公司)，具體轉(zhuǎn)化方法參照唯地公司產(chǎn)品說明書。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于SD/-Trp(Takara，Dalian，China)固體培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)。 2 d后，分別挑取上述SD/-Trp平板上的單克隆至SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade/X-α-gal平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～4 d，觀察菌落的生長情況以及顏色的變化。

表1 試驗所用引物序列Table 1 Primer sequences used in experiments

1.8 大麥條紋花葉病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)介導(dǎo)的 TaTGA2.2基因沉默

根據(jù)TaTGA2.2基因序列分別設(shè)計擴增5′非翻譯區(qū)以及部分編碼區(qū)和3′非翻譯區(qū)以及部分編碼區(qū)兩個區(qū)域的特異引物(引物序列參見表1)，上下游引物分別引進PacI和NotI酶切位點，用目標片段替換γ-PDS-as陽性對照載體中PDS片段，構(gòu)建γ-TaTGA2.2-1as和γ-TaTGA2.2-2as兩個載體。用MluI酶切BSMV-α、γ載體，用SpeI酶切BSMV-β載體，用BssH II酶切γ-PDS-as、γ-TaTGA2.2-1as和γ-TaTGA2.2-2as載體，并膠回收純化。以線性化產(chǎn)物為模板使用RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems-T7 試劑盒(Promega,美國)進行體外轉(zhuǎn)錄。

取α、β各0.5 μL分別與0.5 μL的γ、γ-PDS-as、γ-gene、γ-TaTGA2.2-1as和γ-TaTGA2.2-2as按 1∶1∶1 混合，再加8.5 μL FES buffer混勻后對三葉期小麥的第二葉進行摩擦接種。具體病毒接種步驟參照Yin等[18]的方法。摩擦FES 緩沖液作為陰性對照，γ-PDS-as作為陽性對照。接種后置于16/8 h光暗周期，25 ℃左右進行培養(yǎng)，定期觀察接種γ-PDS-as小麥葉片的漂白以及病毒癥狀。根據(jù)漂白表型出現(xiàn)時間 (12 d左右)，在小麥的第4葉接種條銹菌CYR23或CYR31，接種方法參照康振生等[13]的方法。接種后0、24、48和120 h采取樣品用于沉默效率檢測及相關(guān)基因的表達量分析，在接種后14 d左右觀察表型。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaTGA2.2基因的克隆結(jié)果

通過PCR擴增得到一條1 000 bp左右的產(chǎn)物(圖1)，利用ORF Finder對克隆測序后的序列進行開放閱讀框(ORF)查找，發(fā)現(xiàn)其具有1 005 bp 的ORF，編碼334個氨基酸。在NCBI網(wǎng)站上進行Blastx搜索分析，結(jié)果顯示TaTGA2.2蛋白與一粒小麥(Triticummonococcum)TGA蛋白(GeneBank：AGH18703.1)同源性高達99%，同時與二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)TGA2類轉(zhuǎn)錄因子(GeneBank：XP_010228695.1)、水稻(Oryzasativa)bZIP轉(zhuǎn)錄因子(GeneBank：BAB72061.1)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)TGA轉(zhuǎn)錄因子(GeneBank：XP_003627926.1)等也高度同源。

TaTGA2.2、AtTGA2.2、TmTGA、OsbZIP和BdTGA2.2分別來源于普通小麥，山羊草、一粒小麥、水稻和二穗短柄草。

圖3 TaTGA2.2 進化樹分析

2.2 TaTGA2.2基因的序列分析

TaTGA2.2基因編碼334個氨基酸，用Compute pI/MW對編碼蛋白分析，發(fā)現(xiàn)其分子量為37.25 KDa，等電點為7.87；利用InterProScan對保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有一個bZIP保守結(jié)構(gòu)域及一個轉(zhuǎn)錄因子TGA類似結(jié)構(gòu)域。利用DNAMAN多序列分析顯示， TaTGA2.2氨基酸序列與其他物種的TGA氨基酸序列之間具有很高的同源性，且都含有bZIP保守結(jié)構(gòu)域(圖2)。系統(tǒng)進化樹分析顯示，TaTGA2.2與一粒小麥(AGH18703.1)、水稻(BAB72061.1)和玉米(XP_008658211.1)等單子葉植物中TGA處于同一大分支，其中與一粒小麥的親緣關(guān)系最近，二穗短柄草、玉米次之(圖3)。為了比較TaTGA2.2與不同類型的TGA家族轉(zhuǎn)錄因子之間的進化關(guān)系，選擇9個擬南芥TGA家族轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建進化樹，結(jié)果顯示TaTGA2.2與AtTGA2/5/6(Clade II)屬于同一進化枝(圖4)。

圖4 TaTGA2.2蛋白與9個擬南芥TGA蛋白的同源性分析

2.3 TaTGA2.2的表達模式

接種條銹菌后TaTGA2.2的表達水平如表2所示。在非親和體系中TaTGA2.2在24 h顯著上調(diào)表達，大約是對照表達量的9倍，之后開始下降，在120 h恢復(fù)到基礎(chǔ)表達水平。親和體系中，TaTGA2.2的表達趨勢與非親和體系基本一致，但整體表達水平較低。以上結(jié)果表明，TaTGA2.2受條銹菌誘導(dǎo)表達，并且可能在小麥抗條銹菌過程中發(fā)揮一定作用。

表2 條銹菌誘導(dǎo)下 TaTGA2.2的表達量Table 2 Relative expression of TaTGA2.2 induced by Pst

從表3可知，SA處理2 h和6 h后TaTGA2.2的表達量顯著上調(diào)，之后表達量降至基礎(chǔ)水平；ABA處理6 h后也顯著上調(diào)；JA和ET對TaTGA2.2表達量的影響不大。表明TaTGA2.2基因可能參與SA和ABA相關(guān)信號途徑。

表3 TaTGA2.2在激素處理后的相對表達量Table 3 Relative expression of TaTGA2.2 after hormone treatments

從表4可知，TaTGA2.2的表達量在20%PEG 400處理后12 h和24 h顯著上調(diào)；200 mmol·L-1NaCl處理6 h后也有一定程度的上調(diào)，但不顯著；劃傷以及4 ℃低溫處理后其表達量則沒有明顯變化。表明TaTGA2.2基因可能通過提高其表達量來響應(yīng)干旱脅迫。

表4 TaTGA2.2在脅迫處理后的相對表達量Table 4 Relative expression of TaTGA2.2 after stress treatments

2.4 TaTGA2.2蛋白的亞細胞定位

TaTGA2.2與GFP的融合表達載體以及空載體對照同時轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，通過Olympus BX-51熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，TaTGA2.2-GFP融合蛋白定位于細胞核中，而對照組GFP分布于整個細胞中(圖5)。

2.5 TaTGA2.2的酶母自激活驗證結(jié)果

為了檢測TaTGA2.2的轉(zhuǎn)錄激活活性，將融合質(zhì)粒pGBKT7-TaTGA2.247-334和pGBKT7-TaTGA2.21-334以及陰性對照pGBKT7空載分別轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109中。轉(zhuǎn)化后的菌株在SD/-Trp缺陷培養(yǎng)基上都生長良好，表明三個重組質(zhì)粒都成功轉(zhuǎn)入酵母中，然而只有轉(zhuǎn)入pGBKT7-TaTGA2.21-334的菌株才能在SD/-Trp-His-Ade缺陷培養(yǎng)基上正常生長，并且轉(zhuǎn)入pGBKT7-TaTGA2.21-334的菌株在含有X-α-gal的SD/-Trp-His-Ade的培養(yǎng)基上變成藍色(圖6)，表明TaTGA2.2能夠激活His等報告基因的表達。以上結(jié)果表明，TaTGA2.2具有轉(zhuǎn)錄激活活性，并且轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域位于N端前46個氨基酸序列中。

A：轉(zhuǎn)化菌株在SD/-Trp培養(yǎng)基上的生長情況；B：轉(zhuǎn)化菌株在SD/-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上的生長情況；C：轉(zhuǎn)化菌株在含有X-α-gal的SD/-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上的生長情況；D：指示相應(yīng)檢測載體。

2.6 TaTGA2.2基因沉默后的表型及分析

為了進一步分析TaTGA2.2的功能，借助條銹菌 CYR23 與小麥水源 11的非親和互作體系及CYR31 與小麥水源 11的親和互作體系，進行了病毒介導(dǎo)的VIGS試驗。在摩擦接種空病毒BMSV:γ以及重組病毒BMSV:TaTGA2.2-1as和BMSV:TaTGA2.2-2as 12 d后，葉片均出現(xiàn)輕度退綠、花斑癥狀，而接種BMSV:PDS-as的葉片出現(xiàn)明顯的漂白現(xiàn)象(圖7-A)。對沉默的植株、FES處理以及接空病毒的對照組植株分別接種條銹菌CYR23和CYR31兩個生理小種，14 d后進行表型觀察(圖7-B)，發(fā)現(xiàn)在親和組合中，對照組和試驗組均大量產(chǎn)孢，產(chǎn)孢數(shù)量無明顯差異；在非親和組合中，對照組和實驗組均出現(xiàn)典型的過敏性壞死，表型上無明顯差異。

A：接種空病毒BMSV:γ、重組病毒BMSV: TaTGA2.2-1as和BMSV: TaTGA2.2-2as以及BMSV:PDS 9 d后的病毒癥狀；B：沉默葉片接種條銹菌CRY23和CYR31的表型。

為確定目的基因的沉默效率，在接種0、24、48和120 h后取樣，利用qRT-PCR技術(shù)進行表達量分析，結(jié)果顯示TaTGA2.2的表達受到顯著抑制，沉默效率在60%～80%之間(圖8)。同時檢測可能與TaTGA2.2發(fā)揮功能相關(guān)基因 (NPR1、PR1、PR2以及PR5)的表達水平，發(fā)現(xiàn)TaTGA2.2沉默后，與對照組相比NPR1在120 h顯著上調(diào)，而PR1、PR2以及PR5的表達水平在沉默前后均無明顯變化(圖9)。

*表示與對照組相比差異顯著。

*表示與對照組相比差異顯著。

3 討 論

bZIP類轉(zhuǎn)錄因子是許多植物發(fā)育和生理過程的主要調(diào)節(jié)因子，包括胚的形態(tài)發(fā)育、種子的形成、非生物以及生物脅迫響應(yīng)等[19]。bZIP基因表達模式的調(diào)整和活性的改變通常會導(dǎo)致各種信號途徑以及不同生理過程調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的激活[20]。由TGA組成的一類bZIP轉(zhuǎn)錄因子作為SA信號的調(diào)控因子參與植物對生物脅迫的響應(yīng)應(yīng)答[21]。

本研究克隆得到一個小麥基因TaTGA2.2，編碼bZIP類轉(zhuǎn)錄因子。通過同源性比對以及結(jié)構(gòu)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該序列包含典型的bZIP保守結(jié)構(gòu)域和TGA轉(zhuǎn)錄因子類似結(jié)構(gòu)域，據(jù)此推測TaTGA2.2為小麥TGA家族bZIP轉(zhuǎn)錄因子。典型的轉(zhuǎn)錄因子具有核定位信號(NLS)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)[22]，利用擬南芥原生質(zhì)體亞細胞定位試驗證明TaTGA2.2定位于細胞核，同時利用酵母實驗表明 TaTGA2.2的N端具有轉(zhuǎn)錄激活活性。以上結(jié)果表明TaTGA2.2是一個小麥TGA家族轉(zhuǎn)錄因子，在植物細胞核中作為轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能。

植物通過調(diào)整bZIP基因的表達模式激活不同的信號通路，從而調(diào)節(jié)不同的生理過程[20]。本研究對TaTGA2.2基因在小麥與條銹菌互作中的表達模式進行了分析，發(fā)現(xiàn)TaTGA2.2在非親和互作中表達量明顯上調(diào)，與TabZIP1在小麥與條銹菌非親和互作中表達類似[23]。因此推測TaTGA2.2可能參與調(diào)控小麥對條銹菌的防御反應(yīng)。另外，植物激素介導(dǎo)的系統(tǒng)信號能影響植物的抗病性水平，SA信號調(diào)控植物對活體營養(yǎng)病原菌以及半活體營養(yǎng)病原菌的抗性，而JA和ET的組合則激活植物對腐生營養(yǎng)病原菌的抗性[24]，通常這兩個信號途徑起相反的作用，提高對活體營養(yǎng)病原菌的抗性會伴隨著對腐生營養(yǎng)病原菌的感病性的增加，反之亦然[25]。我們發(fā)現(xiàn)TaTGA2.2的表達量在外源激素SA處理的早期顯著上調(diào)，而受JA和ET影響不大，表明TaTGA2.2可能與SA信號途徑介導(dǎo)的抗性相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)TGA家族成員能與一個錨蛋白NPR1互作[21]，SA誘導(dǎo)下NPR1首先解聚形成單體，然后通過核孔進入到核中[26]，最后作為一個輔助激活因子結(jié)合TGA2形成PR1啟動子上的增強[27-28]。據(jù)此推斷，TaTGA2.2可能通過與NPR1互作參與SA信號途徑介導(dǎo)的小麥對條銹菌的防御反應(yīng)。此外，一些bZIP蛋白還參與植物對環(huán)境因素脅迫的響應(yīng)，包括鹽和干旱脅迫[19]。例如，ABF/AREB蛋白通過ABA依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑響應(yīng)干旱和鹽脅迫[29-30]。擬南芥中過表達ABF3和ABF4導(dǎo)致ABA/脅迫調(diào)控基因的表達水平改變，植株蒸騰作用減少及干旱耐受性增強[31]。試驗表明TaTGA2.2也受外源激素ABA以及干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達，推測TaTGA2.2可能還參與ABA信號介導(dǎo)的植物對干旱和高鹽脅迫的響應(yīng)過程。

本研究利用VIGS技術(shù)對TaTGA2.2進行沉默，發(fā)現(xiàn)接種不同條銹菌小種以后表型沒有出現(xiàn)明顯差異。研究發(fā)現(xiàn)受SA類似物INA誘導(dǎo)的PR-1基因的表達以及病原體的抗性在擬南芥tga6-1tga2-1tga5-1三重突變體中被抑制，然而在tga6-12和tga2-1tga5-1突變體中則不被抑制。此外還發(fā)現(xiàn)單個TGA2或者TGA5就能補足由于TGA三重突變體導(dǎo)致的SAR表型的喪失，表明TGA2、TGA5和TGA6對誘導(dǎo)SAR是必要的，但功能上卻又是冗余的[32]。介于TaTGA2.2與擬南芥TGA2/5/6的高度同源性，推測小麥TGA家族成員也存在功能冗余，TaTGA2.2沉默后其他TGA家族成員能夠彌補由于TaTGA2.2沉默導(dǎo)致的功能缺陷。TaTGA2.2沉默后PR基因的表達水平與對照相比沒有明顯差異，進一步證實了以上推測。鑒于TGA家族成員能通過與NPR1互作在SA信號途徑中發(fā)揮重要作用，對沉默TaTGA2.2后NPR1的表達水平進行了檢測，發(fā)現(xiàn)其在120 h顯著上調(diào)，推測可能由于在非親和體系中，條銹菌的侵染誘導(dǎo)SA含量增加，NPR1的表達量隨之上調(diào)，而TaTGA2.2的沉默影響了NPR1與其之間互作層面的平衡關(guān)系，導(dǎo)致NPR1蛋白的積累，具體機理還有待進一步研究。