陳 霞，鐘 勛，梁 卉，張曉萍，周 敏

（1.萍鄉(xiāng)衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，江西 萍鄉(xiāng) 337000；2.湘雅萍礦合作醫(yī)院，江西 萍鄉(xiāng) 337000）

變應(yīng)性鼻炎（Allergic Rhinitis， AR）是一種多基因遺傳和多環(huán)境因素共同影響的鼻變態(tài)反應(yīng)性疾病，患病率為10～20%，主要表現(xiàn)為鼻塞、流清水涕、噴嚏、鼻癢，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。AR發(fā)病機(jī)制由多種細(xì)胞因子、炎癥細(xì)胞、信號(hào)通路以及炎性介質(zhì)等共同參與。中醫(yī)藥在治療變應(yīng)性鼻炎已取得研究成果[1]，雷公藤有激素樣作用但又無(wú)激素的不良反應(yīng)，其作用與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子密切相關(guān)，已用于哮喘的治療研究，但應(yīng)用于AR的研究及作用機(jī)制不明確。因此研究TGF-β1、白介素4（IL-4）在雷公藤對(duì)AR的作用機(jī)制可探索新的治療應(yīng)用，為臨床提供新視角。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

卵清蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。雷公藤甲素購(gòu)自維克奇生物公司。蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海科研生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)大鼠按國(guó)家相關(guān)要求進(jìn)行飼養(yǎng)。光學(xué)顯微鏡（上海光學(xué)37-XB），高靈敏度熒光成像系統(tǒng)（Bio-Rad，上海）。

1.2 建立大鼠模型

將大鼠隨機(jī)分為四組，每組10只:卵清蛋白（OVA）致敏組-模型對(duì)照組，雷公藤甲素（TP）處理組-藥物處理組，氯雷他定（IR）處理組-陽(yáng)性對(duì)照組，和生理鹽水（SC）組-空白對(duì)照組。采用OVA基礎(chǔ)致敏法：以O(shè)VA混懸液灌腸，隔日1次，共14天。局部致敏：第15天始，TP組和IR組以O(shè)VA+生理鹽水滴注鼻腔予局部激發(fā)，1次/天，連續(xù)10天，同時(shí)，分別以雷公藤甲素和氯雷他定灌胃，1次/天。SC組和OVA組以生理鹽水滴鼻，1次/天，且等量生理鹽水灌胃，連續(xù)10天。

1.3 癥狀評(píng)分

鼻分泌物流至前鼻孔處，噴嚏次數(shù)1～3個(gè)且輕撓鼻部，記1分；鼻分泌物流至滿面，噴嚏次數(shù)大于11個(gè)且劇烈撓鼻面部，記3分；介于二者之間記2分。

1.4 標(biāo)本采集與制備

心臟放血法將大鼠處死，取游離雙側(cè)鼻粘膜組織，置于40 g/L多聚甲醛固定4～6小時(shí)，常規(guī)石蠟包埋，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，每張切片觀察5個(gè)高倍視野，取其平均值。

1.5 Weston-Blot法檢測(cè)鼻粘膜組織中TGF-β1，IL-4蛋白表達(dá)水平

按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白提取，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白變性，制備好的蛋白樣品加入10%的凝膠中行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，取膜，脫脂牛奶封閉，一抗（1:500）4℃孵育過(guò)夜，PBS液洗膜3次；孵育二抗（1:300），PBS洗膜3次，顯色曝光后凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)前后癥狀學(xué)比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 癥狀學(xué)觀察

除SC組外，造模后各組小鼠均出現(xiàn)不同程度變應(yīng)性癥狀，評(píng)分均大于5分，見(jiàn)表1，各組分別與SC組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；但TP組和IR組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 干預(yù)治療前后癥狀評(píng)分

2.2 各組鼻粘膜組織病理學(xué)觀察

OVA組：鼻粘膜組織明顯腫脹，增厚，毛細(xì)血管擴(kuò)張，杯狀細(xì)胞增多，大量嗜酸粒細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。TP組：鼻粘膜輕度腫脹，毛細(xì)血管未見(jiàn)明顯擴(kuò)張，少量嗜酸性粒細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。IR組：病理表現(xiàn)與處理TP組相似。SC組：未見(jiàn)明顯異常。

2.3 各組鼻粘膜組織中TGF-β1、IL-4的表達(dá)

與SC組比較，OVA組TGF-β1和IL-4含量較高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與OVA組比，IR組和TP組中TGF-β1和IL-4含量均較低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TP組TGF-β1和IL-4含量稍低于IR組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

3 討 論

AR是由多種物質(zhì)共同參與的慢性氣道炎癥，具有典型的臨床表現(xiàn)和病理學(xué)改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果OVA組符合典型AR的改變，而TP和IR組經(jīng)干預(yù)后變應(yīng)性癥狀及病理學(xué)變化明顯改善。表明雷公藤甲素干預(yù)作用與氯雷他的治療定效果相當(dāng)。IL-4，IL-5等炎癥細(xì)胞因子可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生、聚集、活化、脫顆粒，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生IgE等介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答及變態(tài)反應(yīng)，從而產(chǎn)生鼻粘膜炎癥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OVA組嗜酸性粒細(xì)胞和IL-4表達(dá)水平較IR組明顯升高，而TP組較IR組明顯降低，OVA組大鼠的變態(tài)反應(yīng)癥狀學(xué)得分較IR組明顯升高，TP組較IR組得分明顯降低，三者綜合表明雷公藤甲素可降低IL-4的發(fā)生，抑制嗜酸性粒細(xì)胞的生成，從而減輕粘膜細(xì)胞腫脹，減輕毛細(xì)血管擴(kuò)張，最終減輕或抑制鼻腔粘膜細(xì)胞的變態(tài)反應(yīng)作用。

TGF-β1是一種多功能細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，對(duì)人體免疫起調(diào)節(jié)作用，中藥可通過(guò)局部的信號(hào)通路調(diào)節(jié)抑制TGF-β1的生成，從而減輕氣道重塑。雷公藤類藥物具有廣泛的免疫抑制和激素樣作用，但無(wú)激素樣副作用，已成功應(yīng)用于支氣管哮喘的臨床治療研究[2]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雷公藤甲素可顯著抑制TGF-β1的表達(dá)及嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞產(chǎn)生，減輕鼻粘膜組織的腫脹，減輕鼻變態(tài)反應(yīng)癥狀，與氯雷他定相比，同樣可以改善AR。眾多研究表明，呼吸道粘膜的氣道反應(yīng)是通過(guò)TGF-β1信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，因此，雷公藤甲素可通過(guò)抑制IL-4的生成，局部鼻粘膜的TGF-β1低表達(dá)，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少，從而使鼻粘膜細(xì)胞的腫脹減輕，癥狀得到緩解，這可能是雷公藤甲素抑制鼻變態(tài)反應(yīng)的重要機(jī)制，可為雷公藤于臨床治療AR提供新思路，但如何調(diào)節(jié)TGF-β1的表達(dá)仍需進(jìn)一步研究。