蔣子昂 王陶濤 程加樂(lè) 展格格 谷雪蓮

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 200093

0 引 言

體外循環(huán)是利用一系列特殊人工裝置將回心靜脈血引流到體外，通過(guò)人工方法進(jìn)行氣體交換、調(diào)節(jié)溫度、過(guò)濾等處理后，輸回體內(nèi)動(dòng)脈系統(tǒng)的生命支持技術(shù)[1]。血泵是體外循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分，目前最常用的血泵形式為滾壓式血泵[2]。在體外循環(huán)過(guò)程中，血紅細(xì)胞易受擠壓、碰撞，容易發(fā)生細(xì)胞膜破損，導(dǎo)致血紅蛋白外流。該現(xiàn)象被稱為溶血，其普遍存在基于血液透析儀、心肺機(jī)等循環(huán)裝置的體外循環(huán)應(yīng)用中[3]。

體外循環(huán)應(yīng)用中，不同類(lèi)型手術(shù)對(duì)手術(shù)時(shí)間與血液流速有不同的需求，其中溶血與手術(shù)時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系[4]。患者失血過(guò)多且血源不足時(shí)，臨床上常用生理鹽水降低血液濃度[5]。因此，研究流速、時(shí)間與血液濃度對(duì)血液的影響具有較高的科研與應(yīng)用價(jià)值，有利于提高手術(shù)的安全性。

目前，針對(duì)血泵溶血的研究，主要利用計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)（computational fluid dynamics，CFD）的方法。例如，通過(guò)CFD技術(shù)對(duì)血泵中的流場(chǎng)進(jìn)行仿真，可得出溶血情況與血泵轉(zhuǎn)速正相關(guān)的結(jié)論[6-9]。Kamei等[10]以及 Pohlmann和 Hameyer[11]和使用 ANSYS ICEM CFD軟件，分析血泵中流場(chǎng)的各項(xiàng)因素，以檢驗(yàn)血泵的安全性與血泵參數(shù)。此外，也有研究者通過(guò)體外水動(dòng)力學(xué)測(cè)試的方法，分析血泵在工作中的力學(xué)參數(shù)，以得出更符合實(shí)際的數(shù)據(jù)[12-15]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)基于血液體外循環(huán)實(shí)驗(yàn)的血泵研究。

本研究中，依據(jù)相關(guān)體外溶血實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[16]，搭建循環(huán)實(shí)驗(yàn)裝置，分析循環(huán)時(shí)間、血泵轉(zhuǎn)速等因素對(duì)滾壓式血泵工作中溶血的影響。

1 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

血泵溶血模擬實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)如圖1所示。系統(tǒng)主要由血袋、循環(huán)裝置、模擬管路等組成。系統(tǒng)設(shè)計(jì)有采血口，便于血液采樣。系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)，管路在循環(huán)裝置的擠壓作用下，其中的血液開(kāi)始流動(dòng)并從血袋中流出，血液流經(jīng)模擬管路后最終流回血袋，從而構(gòu)成循環(huán)。為減小實(shí)驗(yàn)部件對(duì)血液的破壞，設(shè)計(jì)時(shí)盡量減少阻尼閥的使用，并使用生物相容性較好的醫(yī)用耗材，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.1 體外循環(huán)裝置

所使用的體外循環(huán)裝置為WEL-1000HC型心肺機(jī)（天津匯鑫醫(yī)用設(shè)備有限公司），其機(jī)頭為平臥雙柱滾壓式血泵，如圖2所示。血泵的血液流速調(diào)節(jié)范圍為0～9.99 L/min，可模擬不同手術(shù)條件下的血液流速。

1.2 模擬管路

模擬管路由導(dǎo)管和三通閥等組成。導(dǎo)管為血液相容性較好的醫(yī)用聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）軟管，其內(nèi)徑 8 mm，外徑 10 mm，長(zhǎng) 1～1.5 m。10 mm的外徑可保證導(dǎo)管順利通過(guò)滾壓泵。三通閥為一次性使用型，材質(zhì)為硬質(zhì)PVC[17]。三通閥有3個(gè)端口，其一端與裝有血液的PVC血袋[18]的出口相連，另外兩端分別連接導(dǎo)管以及作為采血口，所有連接處均用醫(yī)用黏著劑固定。導(dǎo)管的另一端與血袋的入口相連。采血口的開(kāi)閉由三通閥的旋鈕進(jìn)行控制。（圖 1）

2 方法

2.1 血樣采集與分析

采用美國(guó)材料試驗(yàn)學(xué)會(huì)推薦的動(dòng)物血液溶血實(shí)驗(yàn)血液取用標(biāo)準(zhǔn)選取血液[19]。血液來(lái)源為健康的實(shí)驗(yàn)豬，通過(guò)靜脈穿刺采集血液，采集到的新鮮血液進(jìn)行檸檬酸鈉抗凝處理[20]，處理后的血液置于0～4℃冰箱中保存。0～4℃時(shí)，血液的有效期為35 d[21]，但為了確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，所有實(shí)驗(yàn)均在采血后7 d內(nèi)完成。

有研究結(jié)果表明，血液稀釋后，其凝血功能與血液稀釋程度相關(guān)[4]。在血液與生理鹽水的溶液中，血液的體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，其凝血進(jìn)程加快；血液體積分?jǐn)?shù)為70%和60%時(shí)，凝血過(guò)程未受影響；血液體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，血液凝血能力開(kāi)始減弱；血液體積分?jǐn)?shù)低于40%時(shí)，其凝血能力受到嚴(yán)重影響。因此，本研究中在研究血液濃度對(duì)溶血的影響時(shí)，選取血液體積分?jǐn)?shù)為60%和70%兩個(gè)水平。

圖1 血泵溶血模擬實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)示意圖

圖2 心肺機(jī)的平臥雙柱滾壓式血泵

用生理鹽水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液）配制體積分?jǐn)?shù)分別為70%（1 000 ml）和60%（4 000 ml，平均分為4份）的血液。從每組血液中抽取10 ml用于配制陽(yáng)性對(duì)照（5 ml）和陰性對(duì)照（5 ml）。其中，處理陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，在5 ml血液中加入8 ml蒸餾水，置入37℃水浴箱中保溫30 min；處理實(shí)驗(yàn)樣本和陰性對(duì)照時(shí)，在5 ml血液中加入8 ml的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液，置入HH-W420型水浴箱（深圳惠利得電子科技有限公司）并在37℃下保溫30 min。

2.2 血泵參數(shù)對(duì)溶血的影響

將各實(shí)驗(yàn)組血液分別加入血袋并標(biāo)記。將血袋安裝到心肺機(jī)中，并使導(dǎo)管繞過(guò)平臥雙柱滾壓式血泵。血液流速分別設(shè)置為 1、2、3、4 L/min，每組實(shí)驗(yàn)持續(xù)60 min，每隔10 min從采血口取5 ml血液樣本。采集到的樣本按2.1節(jié)中的步驟進(jìn)行處理用于測(cè)試。各組實(shí)驗(yàn)參數(shù)如表1所示。

表1 血泵溶血實(shí)驗(yàn)分組

2.3 分析方法

所有處理過(guò)的血液用TD5A-WS離心機(jī)（湖南湘儀有限公司）在800 r/min離心5 min；此后，吸取上清液作為檢驗(yàn)液，倒入石英比色皿中；取同體積的水置于石英比色皿中，作為空白對(duì)照液。使用L5S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密儀器儀表有限公司）測(cè)量所有被測(cè)樣品在545 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

以溶血率表示血液的被破壞程度，以陽(yáng)性對(duì)照的吸光度和陰性對(duì)照的吸光度作為比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)。溶血率的計(jì)算公式為

式中：Dt為實(shí)驗(yàn)樣品吸光度；Dnc為陰性對(duì)照吸光度；Dpc為陽(yáng)性對(duì)照吸光度。使用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，所得溶血率數(shù)據(jù)采用一階線性擬合繪制曲線，分析變化規(guī)律。

3 結(jié)果

3.1 循環(huán)時(shí)間對(duì)溶血的影響

血泵的不同工作條件對(duì)血液溶血的影響結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，在相同血液流速下，血液循環(huán)時(shí)間越長(zhǎng)，溶血率越高。由圖3A中的曲線可以看出，血液流速為1 L/min和2 L/min的血樣在測(cè)試過(guò)程中均發(fā)生了較為明顯的溶血率跳變情況，在循環(huán)時(shí)間超過(guò)30 min后，其曲線線性斜率均明顯增大；但在循環(huán)時(shí)間超過(guò)50 min后，線性斜率又回到30 min前的水平。但是，該現(xiàn)象在血液流速為3 L/min和4 L/min的血樣中則不明顯。

3.2 血液流速對(duì)溶血的影響

如圖3B所示，在相同循環(huán)時(shí)間下，血液流速越高，溶血率越高，表示血紅細(xì)胞越容易被破壞。不同血液流速條件下，血樣溶血率（y）與循環(huán)時(shí)間（x）的擬合曲線表達(dá)式如下

由擬合曲線表達(dá)式可知，血液流速越高，溶血率隨時(shí)間變化擬合曲線的R2值也越趨向于1，表明擬合曲線對(duì)觀測(cè)值的擬合程度越高，觀測(cè)值的線性度越好。

圖3 血泵不同工作條件對(duì)血液溶血的影響

3.3 血液體積分?jǐn)?shù)對(duì)溶血的影響

不同稀釋程度對(duì)血液溶血的影響結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，在血液流速和循環(huán)時(shí)間一定的情況下，體積分?jǐn)?shù)為60%和70%血液的溶血率結(jié)果相近，其線性擬合曲線的表達(dá)式如下

由擬合曲線表達(dá)式可知，血液體積分?jǐn)?shù)為70%血液的溶血率擬合曲線斜率較60%的略高，表明在血液流速和循環(huán)時(shí)間一定的情況下，血液體積分?jǐn)?shù)越高，溶血情況越嚴(yán)重。

圖4 血液體積分?jǐn)?shù)對(duì)溶血的影響

4 討論

血紅細(xì)胞的細(xì)胞膜下方是一個(gè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的膜骨架蛋白。其在短暫的外力下可改變狀態(tài)，但持續(xù)的外力可使膜骨架蛋白之間重新連接，導(dǎo)致血紅細(xì)胞永久變形但不破裂。但是，此狀態(tài)下的血紅細(xì)胞穩(wěn)定性差，再承受外力時(shí)易破碎[22]。Niimi[23]的研究結(jié)果表明，血紅細(xì)胞在受到剪應(yīng)力情況下，其破壞形式主要為細(xì)胞膜的疲勞破壞。

在體外循環(huán)中，循環(huán)時(shí)間越長(zhǎng)，血紅細(xì)胞所受應(yīng)力周期數(shù)越高，越容易進(jìn)入疲勞或亞損傷狀態(tài)，直至發(fā)生溶血。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)，溶血率的回歸平方和在總平方和中所占的比率降低，數(shù)據(jù)逐漸趨于線性、穩(wěn)定。血液流速越高，血紅細(xì)胞所受的剪切力越大，受到的損傷就越嚴(yán)重[23]。因此，溶血率隨血液流速增大而增大，且流速越高，溶血率曲線的線性度越好。血液流速越小，血液內(nèi)部血紅細(xì)胞所受的剪切力越小，越符合血液動(dòng)力學(xué)要求，血液的溶血程度越小[24]。血樣中血液的體積分?jǐn)?shù)越大，其單位體積內(nèi)所包含的血紅細(xì)胞數(shù)越多，在同等循環(huán)條件下，其所受機(jī)械碰撞的概率越大，受損概率越大，溶血情況也越嚴(yán)重。另外，在血液循環(huán)的最初階段，溫度對(duì)溶血的影響較小。但隨著循環(huán)時(shí)間的延長(zhǎng)，血樣的溫度升高，溶血加劇[5]。

此外，由于血紅細(xì)胞在發(fā)生破壞前，會(huì)進(jìn)入亞損傷及細(xì)胞膜疲勞的狀態(tài)。因此，在循環(huán)一段時(shí)間后會(huì)發(fā)生溶血突變的情況[22，25]。本研究中，循環(huán)時(shí)間為0～30 min時(shí)，溶血率曲線斜率較低，而當(dāng)循環(huán)時(shí)間超過(guò)30 min后，大量亞損傷及細(xì)胞膜疲勞的血紅細(xì)胞被完全破壞，反映為溶血率曲線的跳變。但是，隨著血液流速的升高，大量血紅細(xì)胞在發(fā)生亞損傷及細(xì)胞膜疲勞前就已破損，血紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)的微小變化不容易體現(xiàn)。因此，溶血突變的現(xiàn)象在3、4 L/min的血液流速下不明顯。

本研究采用體外實(shí)驗(yàn)的方法研究了血泵參數(shù)及血液稀釋程度對(duì)溶血的影響。但是，因?yàn)椴捎玫氖求w外模擬的方法，部分客觀因素可能造成觀測(cè)值與實(shí)際值有所偏差。例如，抗凝劑的使用會(huì)導(dǎo)致血液pH值驟變[26]，另外血泵運(yùn)轉(zhuǎn)發(fā)熱、能量轉(zhuǎn)移[27]、實(shí)驗(yàn)儀器使用不當(dāng)?shù)榷伎赡軐?dǎo)致溶血。此外，本研究中，采用溶血率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，其反映的是血泵對(duì)血紅細(xì)胞的直接損傷，即血紅細(xì)胞的破裂，不能反映血紅細(xì)胞的亞損傷及其程度，也無(wú)法用來(lái)判斷延遲性溶血（外循環(huán)術(shù)后24 h內(nèi)的溶血）的嚴(yán)重程度[25]。有研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)流血泵中，與細(xì)胞的即時(shí)破損相比，血紅細(xì)胞的亞致死性損傷是更主要的損傷形式，當(dāng)1個(gè)血紅細(xì)胞發(fā)生破損的同時(shí)，可能有500個(gè)發(fā)生細(xì)胞膜變化，并在術(shù)后24 h內(nèi)發(fā)生延遲性溶血[28]。因此，應(yīng)在后續(xù)研究中考慮血紅細(xì)胞的亞損傷情況。

5 結(jié)論

血泵循環(huán)時(shí)間越長(zhǎng)、血泵轉(zhuǎn)速越高（血液流速越高），血紅細(xì)胞越容易發(fā)生破壞，即溶血率與循環(huán)時(shí)間和血液流速成正比。循環(huán)時(shí)間與血液流速一定的情況下，血液濃度越高，越容易發(fā)生溶血。此外，循環(huán)時(shí)間增長(zhǎng)到一定程度時(shí)，溶血率曲線出現(xiàn)拐點(diǎn)，此時(shí)溶血趨勢(shì)會(huì)明顯增強(qiáng)。在外循環(huán)的臨床應(yīng)用中，應(yīng)在保證手術(shù)安全的情況下，盡可能地降低血液流速和血液濃度，以減少溶血；而在患者出現(xiàn)急性失血，其血液濃度受限時(shí)[4]，則應(yīng)在保證安全的情況下，盡可能地降低循環(huán)轉(zhuǎn)速、加快手術(shù)速度，減小溶血的發(fā)生概率。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突