駱雄飛 劉斯文 李華南 張瑋 王金貴 黎波 王強(qiáng)松

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院推拿科，國家中醫(yī)藥管理局推拿手法生物效應(yīng)三級實(shí)驗(yàn)室300193；2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192

0 引 言

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是以腹部不適或腹痛伴隨排便習(xí)慣改變?yōu)樘卣鞯囊环N常見的功能性胃腸道疾病。其中腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D）在IBS亞型中發(fā)病率較高，呈逐年升高趨勢，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和心理狀態(tài)[1]。雖然IBS-D的發(fā)病機(jī)制尚無定論，但腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）病變在腸局部調(diào)控中的關(guān)鍵效應(yīng)對于IBS-D的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。IBS患者多存在免疫異常，其血清抗腸神經(jīng)元抗體誘發(fā)ENS自身免疫反應(yīng)，繼而引起ENS病變，誘導(dǎo)腸膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，肥大細(xì)胞增多，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致腹痛、腹部不適感進(jìn)行性加重[2-4]。中醫(yī)摩腹法可通過手法機(jī)械力在腹部局部做環(huán)形摩動，直接刺激胃腸體表投影的腹部區(qū)域，通過胃腸神經(jīng)叢的局部反射來調(diào)節(jié)胃腸的運(yùn)動功能。本研究采用新生期母子分離方法建立IBS-D大鼠模型，通過觀察摩腹力學(xué)刺激對IBS-D大鼠模型結(jié)腸組織肥大細(xì)胞數(shù)量、腸膠質(zhì)細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)和促炎癥因子表達(dá)的影響，以探討IBS-D發(fā)病與上述指標(biāo)的相關(guān)性以及摩腹力學(xué)刺激調(diào)節(jié)IBS-D腸神經(jīng)系統(tǒng)功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

健康無特定病原體級Wistar雌性孕大鼠10只，體質(zhì)量（200±10）g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXX（京）2014-0004。動物購入后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由攝食飲水，光照節(jié)律為12 h 光照/12 h 黑暗（光照時(shí)間 6∶00～18∶00），室溫（25±2）℃，相對濕度為60%～70%，保持安靜。本研究所有的動物實(shí)驗(yàn)均獲得天津中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

大鼠白細(xì)胞介素-6（interleukelin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（interleukelin-1β，IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）。ZTC-Ⅱ智能推拿手法測定儀（上海中醫(yī)藥大學(xué)和復(fù)旦大學(xué)共同研制），MD1000正置顯微鏡、RM2235石蠟切片機(jī)（德國 Leica Microsystems公司），P2、P10、P20、P100、P200、P1000移液器（美國 Gilson公司），DHG-9023A恒溫烘箱（上海恒一科學(xué)儀器有限公司），TKD-TSF自動組織脫水機(jī)（湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司），TB-718D生物組織自動包埋機(jī)、TB-718L生物組織自動包埋機(jī)（冷臺）（湖北泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司），Hitachi7650透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）。

1.2 方法

1.2.1 IBS-D大鼠模型的建立

采用新生期母子分離方法建立IBS-D大鼠模型：新生大鼠出生當(dāng)天記為第1天；于第2～14天將新生大鼠與母鼠每天分離3 h，保持新生大鼠生活環(huán)境溫度維持在（25±2）℃；分離3 h后將母鼠重新放回原籠中；從第15天起新生大鼠與母鼠共同飼養(yǎng)，不予任何處理，第22天斷奶，第30天分籠飼養(yǎng)。

1.2.2 動物分組與干預(yù)方法

使用隨機(jī)平行對照方法，將60只新生Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組和摩腹組，每組20只。摩腹組大鼠造模后進(jìn)行摩腹力學(xué)刺激干預(yù)，事先采集天津腹部推拿名家王金貴教授的操作手法信息，其所用力大小和頻率均經(jīng)智能推拿手法測定儀標(biāo)定，建立手法操作模型；然后將實(shí)驗(yàn)大鼠仰臥束縛于實(shí)驗(yàn)臺上，將智能推拿手法測定儀的按摩頭置于大鼠腹部結(jié)腸部位進(jìn)行按法力學(xué)刺激，設(shè)定壓力為10 N，維持壓力靜待2 min，如此反復(fù)操作4次；再進(jìn)行摩法力學(xué)刺激，設(shè)定壓力為3 N，做順時(shí)針方向節(jié)律性的環(huán)旋運(yùn)動，頻率20～30 r/min，如此反復(fù)操作12 min；每天按上述方法干預(yù)1次，連續(xù)14 d。模型組大鼠造模后每天被仰臥束縛于實(shí)驗(yàn)臺上5 min，不予摩腹力學(xué)刺激干預(yù)，連續(xù)14 d?？瞻捉M大鼠不造模，不予任何干預(yù)。

1.2.3 大鼠腸動力及內(nèi)臟敏感性的測定

干預(yù)后采用體積分?jǐn)?shù)為2%的異氟烷麻醉各組大鼠（麻醉前禁食12 h），取直徑為3 mm的玻璃小球沿大鼠肛門放入距肛門3 cm的直腸內(nèi)。然后將大鼠轉(zhuǎn)移至籠內(nèi)喂食飲水，籠內(nèi)墊清潔濾紙。自大鼠蘇醒后開始計(jì)時(shí)，記錄大鼠直腸內(nèi)玻璃小球的排出時(shí)間。

干預(yù)后采用腹部回縮反射評分為指標(biāo)觀察各組大鼠對直結(jié)腸氣囊擴(kuò)張的反應(yīng)性，評估內(nèi)臟敏感性，具體操作參見文獻(xiàn)[5]。

1.2.4 蘇木精-伊紅染色觀察大鼠結(jié)腸組織的病理變化

干預(yù)后第2天，采用質(zhì)量濃度為100 g/L的水合氯醛麻醉各組大鼠，腹主動脈取血，收集、分離血漿；頸椎脫臼處死大鼠，截取結(jié)腸，用質(zhì)量濃度為9 g/L的NaCl溶液沖洗干凈，置于質(zhì)量濃度為40 g/L的甲醛溶液中固定；然后進(jìn)行石蠟包埋、切片（厚度為5μm）和蘇木精-伊紅染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠結(jié)腸組織的病理變化。

1.2.5 甲苯胺藍(lán)染色觀察大鼠結(jié)腸組織中肥大細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量變化

取1.2.4節(jié)制備的結(jié)腸組織石蠟切片（每組選4個樣本），采用甲苯胺藍(lán)染色，于光學(xué)顯微鏡下（×200）隨機(jī)選取4個視野，觀察大鼠肥大細(xì)胞的形態(tài)，并連續(xù)計(jì)數(shù)上述4個視野的肥大細(xì)胞數(shù)，取均值作為肥大細(xì)胞密度值。

1.2.6 透射電子顯微鏡觀察大鼠結(jié)腸膠質(zhì)細(xì)胞的超顯微結(jié)構(gòu)

將1.2.4節(jié)中石蠟包埋的結(jié)腸組織進(jìn)行切片（厚度為5μm）；然后通過甲苯胺藍(lán)染色找到特定區(qū)域；經(jīng)超薄切片機(jī)切片（厚度為50～70 nm）后置于銅網(wǎng)上，用質(zhì)量濃度為30 g/L的醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染；最后于透射電子顯微鏡下觀察結(jié)腸膠質(zhì)細(xì)胞的超顯微結(jié)構(gòu)。

1.2.7 大鼠血漿中促炎癥因子IL-6和IL-1β水平的檢測

分別采用IL-6、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測大鼠血漿（1.2.4節(jié)分離得到）中的IL-6和IL-1β水平，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Origin Pro 8.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較使用單因素方差分析（One-Way ANOVA）法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 摩腹力學(xué)刺激對IBS-D大鼠腸動力及內(nèi)臟敏感性的影響

本研究采用玻璃小球排出時(shí)間評價(jià)大鼠的腸動力情況。如圖1A所示，與空白組相比，模型組大鼠的玻璃小球排出時(shí)間明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明造模后大鼠的結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)頻率加快；給予摩腹力學(xué)刺激干預(yù)后，玻璃小球排出時(shí)間較模型組延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明摩腹力學(xué)刺激干預(yù)后IBS-D大鼠的結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能得以改善。

圖1 各組大鼠的玻璃小球排出時(shí)間及腹部抬起容量閾值變化

內(nèi)臟高敏感性是IBS-D的特征生物標(biāo)志物，如圖1B所示，與空白組相比，模型組大鼠的腹部抬起容量閾值明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明造模后大鼠的內(nèi)臟敏感性提高；給予摩腹力學(xué)刺激干預(yù)后，腹部抬起容量閾值較模型組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明摩腹力學(xué)刺激改善了IBS-D大鼠對外部應(yīng)激的敏感性。

2.2 摩腹力學(xué)刺激對IBS-D大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響

各組大鼠結(jié)腸組織的蘇木精-伊紅染色結(jié)果如圖2所示：空白組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，未見炎癥細(xì)胞浸潤和間質(zhì)水腫；模型組大鼠部分結(jié)腸與腹腔組織粘連，腺體排列疏松，黏膜下層有炎癥細(xì)胞浸潤；而摩腹組大鼠腺體排列疏松，黏膜下層可見輕度充血，癥狀改善明顯。

2.3 摩腹力學(xué)刺激對IBS-D大鼠結(jié)腸組織中肥大細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的影響

對各組大鼠結(jié)腸組織進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，顯微鏡下可見肥大細(xì)胞分布于黏膜固有層和黏膜下層，細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞質(zhì)被染成紫紅色；未脫顆粒者細(xì)胞完整，胞質(zhì)均勻，胞膜清晰；脫顆粒者細(xì)胞膜破裂，顆粒涌出胞膜，細(xì)胞形狀不規(guī)則（圖3）。由圖3可知，與空白組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織中的肥大細(xì)胞數(shù)量明顯增多；給予摩腹力學(xué)刺激干預(yù)后，肥大細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯減少。進(jìn)一步的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果證實(shí)，模型組大鼠結(jié)腸組織中的肥大細(xì)胞數(shù)量[（5.61±0.12）個/視野]多于空白組[（0.52±0.02）個/視野]和摩腹組[（2.64±0.22）個/視野]，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.4 摩腹力學(xué)刺激對IBS-D大鼠結(jié)腸膠質(zhì)細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)的影響

透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠結(jié)腸膠質(zhì)細(xì)胞中線粒體數(shù)目明顯增加，異染色質(zhì)密度明顯降低；給予摩腹力學(xué)刺激干預(yù)后，線粒體數(shù)目較模型組減少，異染色質(zhì)密度較模型組升高（圖4）。

2.5 摩腹力學(xué)刺激對IBS-D大鼠促炎癥因子IL-6和IL-1β分泌的影響

由圖5可知，與空白組相比，模型組大鼠血漿中的IL-6和IL-1β水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；給予摩腹力學(xué)刺激干預(yù)后，血漿中的IL-6和IL-1β水平較模型組明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖2 蘇木精-伊紅染色觀察各組大鼠結(jié)腸組織的病理變化（×200）

圖3 甲苯胺藍(lán)染色觀察各組大鼠結(jié)腸組織中肥大細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量變化（×100）

圖4 透射電子顯微鏡觀察各組大鼠結(jié)腸膠質(zhì)細(xì)胞的超顯微結(jié)構(gòu)（×700）

圖5 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測各組大鼠血漿中促炎癥因子IL-6和IL-1β的水平

3 討論與結(jié)論

中醫(yī)將IBS-D歸屬于“腹痛”、“泄瀉”范疇，認(rèn)為該病多因脾失健運(yùn)，運(yùn)化失常致病理產(chǎn)物累積，阻礙中焦氣機(jī)，進(jìn)而導(dǎo)致腸道功能失調(diào)，出現(xiàn)腹脹、腹瀉等臨床癥狀。腹部居人體之中，為上下聯(lián)結(jié)之樞，與五臟六腑關(guān)系密切。胃主受納水谷，推陳降濁；大腸主傳導(dǎo)變化，吸收精微，兩者功能協(xié)調(diào)，才能使氣血通和。摩腹法可通過調(diào)理胃腸氣機(jī)，治療相應(yīng)臟腑病證，對消化系統(tǒng)疾病具有顯著療效。正如《理瀹駢文》所言：“后天之本在脾，調(diào)中者摩腹?！迸R床研究結(jié)果證實(shí)，摩腹法可有效治療IBS-D，改善患者的臨床癥狀[6]。

腸道功能紊亂是IBS-D評價(jià)的主要指標(biāo)之一。本研究中IBS-D大鼠腸道功能紊亂表現(xiàn)為玻璃小球排出時(shí)間明顯縮短；同時(shí)，與正常大鼠相比，IBS-D大鼠的內(nèi)臟敏感性降低，這與IBS-D患者的臨床表現(xiàn)一致[7]；而摩腹力學(xué)刺激能明顯延長IBS-D大鼠的玻璃小球排出時(shí)間，提高內(nèi)臟敏感性。雖然IBS的發(fā)病機(jī)制尚未清楚，但精神心理因素是影響IBS的主要因素[8]。文獻(xiàn)報(bào)道，肥大細(xì)胞數(shù)量與IBS癥狀嚴(yán)重程度（焦慮、抑郁評分）呈正相關(guān)[9]。肥大細(xì)胞在IBS的病理過程中發(fā)揮著重要作用，其可能是連接腸道組織與神經(jīng)系統(tǒng)的主要介質(zhì)[10]。本研究結(jié)果顯示，摩腹力學(xué)刺激能明顯減少肥大細(xì)胞數(shù)量，減緩IBS的癥狀。

腸膠質(zhì)細(xì)胞具有與腦星形膠質(zhì)細(xì)胞相似的功能，在腸壁中形成廣泛的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)[11]。腸膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)連接腸上皮和黏膜下層的ENS，在維持腸道功能穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[12]。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IBS患者結(jié)腸膠質(zhì)細(xì)胞中的異染色質(zhì)密度顯著降低，線粒體數(shù)目增加[13]。本研究通過透射電子顯微鏡觀察大鼠結(jié)腸膠質(zhì)細(xì)胞的超顯微結(jié)構(gòu)改變，結(jié)果表明，摩腹力學(xué)刺激能明顯升高IBS-D大鼠結(jié)腸膠質(zhì)細(xì)胞中的異染色質(zhì)密度，減少線粒體數(shù)目。近年來研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腸膠質(zhì)細(xì)胞的功能受多種因素影響，如促炎細(xì)胞因子[14]等。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測大鼠血漿中促炎癥因子IL-6和IL-1β水平的變化，結(jié)果顯示，與空白組相比，IBS-D大鼠血漿中的IL-6和IL-1β水平明顯升高，給予摩腹力學(xué)刺激干預(yù)后，血漿中的IL-6和IL-1β水平明顯降低，表明摩腹力學(xué)刺激能減少促炎癥因子的分泌，調(diào)節(jié)結(jié)腸膠質(zhì)細(xì)胞的功能。

本研究結(jié)果提示摩腹力學(xué)刺激可提高IBS-D大鼠的內(nèi)臟敏感性，減少結(jié)腸組織中的肥大細(xì)胞數(shù)量和結(jié)腸膠質(zhì)細(xì)胞中的線粒體數(shù)目，升高結(jié)腸膠質(zhì)細(xì)胞中的異染色質(zhì)密度，還可減少促炎癥因子IL-6和IL-1β的分泌，從而起到調(diào)節(jié)ENS的作用，其作用機(jī)制可能與腸-腦軸有關(guān)。鑒于本研究的樣本量較少、研究周期較短等因素，摩腹力學(xué)刺激治療IBS-D的具體起效機(jī)制和作用靶點(diǎn)尚未完全清楚，還需進(jìn)一步的深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突