譚雅超 李泉曉 康亞玲 羅小龍 張愛(ài)蓮

新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830046

0 引言

目前佐劑已用于大多數(shù)滅活疫苗的制備，但因其發(fā)展緩慢，僅有少數(shù)佐劑被批準(zhǔn)用于人類(lèi)，如鋁佐劑、流感疫苗佐劑MF59、乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus,HBV）佐劑CpG等[1-3]。其中鋁佐劑是典型的輔助性 T 細(xì)胞 2（helper Tcel l 2，Th2）型佐劑，主要用于滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎、肺炎鏈球菌、白喉百菌、破傷風(fēng)等疫苗，而對(duì)于人類(lèi)免疫缺陷病毒、HBV、流感病毒或腫瘤等，則需能夠激發(fā)T細(xì)胞免疫的輔助性T細(xì)胞1（helper Tcell 1，Th1）型佐劑[4]。因此，篩選安全性好且能激發(fā)Th1/Th2型免疫反應(yīng)，尤其能激發(fā)Th1型免疫反應(yīng)的疫苗佐劑對(duì)于人類(lèi)和動(dòng)物傳染病的防治具有重要意義。

中草藥多糖具有抗病毒、抗腫瘤和抗氧化等免疫調(diào)節(jié)功能，且具有較好的安全性，故被作為候選疫苗佐劑。例如植物來(lái)源的佐劑菊粉多糖AdvaxTM，作為HBV佐劑能增強(qiáng)其抗體水平，提高抗HBV CD4＋CD8＋T細(xì)胞比例，以及促進(jìn)Th1/Th2細(xì)胞因子的表達(dá)[5]；作為流感疫苗佐劑能促進(jìn)初生小鼠IgG及其分型的分泌，并能提高小鼠在致死性感染中的存活率[6]。新疆野生荒漠肉蓯蓉是新疆地區(qū)特有的寄生性益補(bǔ)類(lèi)中草藥，其多糖成分具有增強(qiáng)免疫力的作用[7-8]。筆者所在課題組的前期研究結(jié)果表明，新疆野生荒漠肉蓯蓉粗多糖（wild Cistanche deserticola Y.C.Ma crude polysaccharides,WCDCP）可顯著促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟并增強(qiáng)其功能，具有潛在的佐劑活性[9-10]。因此，本研究選取模式抗原卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）作為免疫抗原，探討WCDCP作為OVA佐劑免疫小鼠后對(duì)小鼠體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響，評(píng)價(jià)其作為OVA佐劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

WCDCP（筆者所在實(shí)驗(yàn)室提取制備[10]），胎牛血清（以色列 Biological Industries公司），OVA（美國(guó)Sigma公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、IgG1與IgG2a抗體（美國(guó)SouthernBiotech公司），3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司），RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司），藻紅蛋白（phycocyanin，PE）標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD3抗體（PE-CD3）、別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD4抗體（APC-CD4）、異硫氰酸熒光素（flourescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD8抗體（FITC-CD8）、PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD44抗體（PE-CD44）（美國(guó)BD公司），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

健康清潔級(jí)6～8周齡ICR雌性小鼠42只，體質(zhì)量范圍18～22 g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心，許可證號(hào)SC XK（京）2016-0011。本研究所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲得新疆大學(xué)生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（BRGE-AE001）。

ELx808全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek儀器有限公司），Sorvall Legend Micro17微量離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），TD-5Z臺(tái)式低速多管架離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司），BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及免疫

ICR雌性小鼠于動(dòng)物室內(nèi)分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度為（24±1）℃，相對(duì)濕度為（50±10）%，每天 12 h光照、12 h黑暗，自由飲食進(jìn)水。將42只ICR小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為7組（每組6只）：9g/LNaCl組（空白對(duì)照組）、WCDCP組（400μg WCDCP）、OVA 組（10μgOVA）、低劑量WCDCP/OVA組（100μgWCDCP＋10μg OVA）、中劑量WCDCP/OVA組（400μgWCDCP＋10μg OVA）、高劑量WCDCP/OVA組（800μgWCDCP＋10μg OVA）、鋁佐劑/OVA組（陽(yáng)性對(duì)照組，200μg鋁佐劑＋10μg OVA）。采用兩點(diǎn)注射于小鼠后腿肌內(nèi)進(jìn)行免疫，每只注射體積100μl，共免疫2次，初次免疫后間隔2周加強(qiáng)免疫1次。

1.2.2 血清制備及小鼠體質(zhì)量檢測(cè)和生長(zhǎng)狀態(tài)觀察

分別于小鼠初次免疫后 7、14、21、28 d眼眶取血，所得血漿置于37℃恒溫箱30 min，再轉(zhuǎn)入4℃冰箱30 min，986×g離心10 min，吸取上層血清于-20 ℃保存。每次采血前（0、7、14、21、28 d）稱(chēng)量小鼠體質(zhì)量，觀察小鼠體質(zhì)量和生長(zhǎng)狀態(tài)變化。

1.2.3 間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)IgG抗體及抗體分型水平

以適當(dāng)濃度的OVA包被酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定板，37℃孵育1 h后4℃過(guò)夜；用含體積分?jǐn)?shù)為0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液[phosphate buffered saline with 0.05%（v/v）Tween 20，PBST]洗板，加入封閉液 37 ℃孵育1 h；PBST洗板，加入按不同比例稀釋的待測(cè)血清，37℃孵育1 h；PBST洗板，分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、IgG1與IgG2a，37℃放置 1 h；PBST 洗板，加入 3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺顯色液，避光顯色10～15 min，加入終止液，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔于450 nm處的吸光度（A450）值。

1.2.4 噻唑藍(lán)法檢測(cè)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖

初次免疫后21 d，取小鼠脾臟，經(jīng)研磨、過(guò)濾、裂解紅細(xì)胞后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，加入96孔板中；分別加入刀豆蛋白A、脂多糖和特異性抗原OVA刺激細(xì)胞，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h；加入噻唑藍(lán)溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入二甲基亞砜振蕩10～15 min；酶標(biāo)儀測(cè)定A490值，并按下式計(jì)算刺激指數(shù)

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟和淋巴結(jié)中T細(xì)胞亞群

初次免疫后21 d，取小鼠脾臟和淋巴結(jié)，均制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml；取1 ml單細(xì)胞懸液于離心管中，加入5 ml含體積分?jǐn)?shù)為0.5%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，290×g離心8 min后棄上清；分別加入PE-CD3、FITC-CD8、APC-CD4、PE-CD44抗體，常溫避光染色30 min；加入含體積分?jǐn)?shù)為0.5%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液終止染色，290×g離心8 min，棄上清；加入300μl磷酸鹽緩沖液吹打均勻，經(jīng)200目銅網(wǎng)過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析和多重比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WCDCP對(duì)小鼠血清IgG抗體及其分型水平的影響

采用間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)初次免疫后不同時(shí)間小鼠的血清IgG抗體水平，結(jié)果如圖1所示，初次免疫后7 d，隨著WCDCP劑量的升高，小鼠的血清IgG抗體水平也升高，其中高劑量WCDCP/OVA組的血清IgG抗體水平（0.597 6±0.110 7）明顯高于 OVA組（0.254 4±0.074 8）和鋁佐劑/OVA組（0.2953±0.0650），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；初次免疫后21 d，低、中、高劑量WCDCP/OVA組的血清 IgG 抗體水平（0.577 2±0.149 9，0.653 2±0.146 0，0.7583±0.163 1）均高于 OVA 組（0.201 6±0.019 7）（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01），且與鋁佐劑/OVA 組（0.5288±0.163 0）相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；初次免疫后28 d，高劑量WCDCP/OVA組的血清IgG抗體水平（0.9723±0.2438）明顯高于OVA組（0.389 2±0.077 4）（P＜0.05），并且與鋁佐劑/OVA 組（0.767 3±0.120 7）相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)初次免疫后不同時(shí)間各組小鼠的血清IgG抗體水平

采用間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)初次免疫后28 d小鼠血清中的IgG1和IgG2a抗體分型水平，結(jié)果如圖2所示，中、高劑量WCDCP/OVA組的IgG1 抗體水平（0.979 3±0.102 5，1.156 0 ±0.088 4）明顯高于 OVA 組（0.612 6±0.059 7）（P＜0.05，P＜0.001），且具有劑量依賴(lài)性，與鋁佐劑/OVA組（0.9452±0.1078）相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；高劑量WCDCP/OVA 組的IgG2a抗體水平（1.648 0±0.103 9）明顯高于OVA組（0.557 2±0.181 5）和鋁佐劑/OVA組（1.145 0±0.153 6），其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，P＜0.05）。

2.2 WCDCP對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響

初次免疫后21 d，分離得到各組小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞，于體外分別采用刀豆蛋白A和脂多糖刺激48 h，噻唑藍(lán)法檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果見(jiàn)圖3，刀豆蛋白A刺激后，中、高劑量WCDCP/OVA組的刺激指數(shù)（2.712±0.159，5.857±0.450）明顯高于OVA 組（1.715±0.092）（P＜0.01，P＜0.001），且高劑量WCDCP/OVA組的刺激指數(shù)明顯高于鋁佐劑/OVA組（2.697±0.437）（P＜0.01）；脂多糖刺激后，低、高劑量WCDCP/OVA組的刺激指數(shù)（5.456±0.352，8.426±1.428）明顯高于 OVA 組（2.874±0.298）（P＜0.01，P＜0.05），且與鋁佐劑/OVA組（4.978±1.460）相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 WCDCP對(duì)小鼠淋巴結(jié)中CD8＋CD44＋T細(xì)胞亞群的影響

初次免疫后21 d，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠淋巴結(jié)中CD8＋CD44＋T細(xì)胞亞群的比例，結(jié)果見(jiàn)圖4，低劑量WCDCP/OVA組小鼠淋巴結(jié)中CD8＋CD44＋T細(xì)胞的比例[（5.93±0.42）%]明顯高于OVA組[（4.17±0.34）%]和鋁佐劑/OVA組[（3.55±0.37）%]，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖2 間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)初次免疫后28 d各組小鼠的血清IgG1和IgG2a抗體分型水平

圖3 噻唑藍(lán)法檢測(cè)初次免疫后21 d各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖情況

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)初次免疫后21 d各組小鼠淋巴結(jié)中的CD8＋CD44＋T細(xì)胞比例

2.4 WCDCP 對(duì)小鼠脾臟中 CD3＋CD8＋T、CD3＋CD4＋T和 CD4＋CD44＋T 細(xì)胞亞群的影響

初次免疫后21 d，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟中 CD3＋CD8＋T、CD3＋CD4＋T 和 CD4＋CD44＋T 細(xì)胞亞群的比例，結(jié)果如圖5所示，低、高劑量WCDCP/OVA組的CD3＋CD8＋T細(xì)胞比例[（11.43±0.69）%，（10．83±0．44）%]明顯高于OVA組[（6.76±0.58）%]（均P＜0.01），且與鋁佐劑/OVA組[（10.95±0.76）%]相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；高劑量WCDCP/OVA組的CD3＋CD4＋T細(xì)胞比例[（28．17±1．67）%]明顯高于OVA組[（19.17±2.73）%]（P＜0.05），并且與鋁佐劑/OVA組[（27.07±1.48）%]相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；低劑量WCDCP/OVA組的CD4＋CD44＋T細(xì)胞比例[（8.24±0.12）%]明顯高于OVA組[（6．25±0．24）%]（P＜0.01），且與鋁佐劑/OVA組[(8.88±1.51)%]相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 WCDCP對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

于初次免疫后不同時(shí)間（0、7、14、21、28 d）稱(chēng)取各組小鼠的體質(zhì)量，結(jié)果如表1所示，初次免疫后相同時(shí)間點(diǎn)各組間體質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。同時(shí)，低、中、高劑量WCDCP/OVA組小鼠的注射位點(diǎn)均未見(jiàn)炎癥反應(yīng)，小鼠生長(zhǎng)狀況正常。上述結(jié)果表明WCDCP對(duì)小鼠的正常生長(zhǎng)無(wú)影響，具有良好的安全性。

3 討論與結(jié)論

不同疫苗所需的佐劑類(lèi)型亦不同，例如鋁佐劑主要誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)（包括抗體的產(chǎn)生），而不能誘導(dǎo)針對(duì)病原體的Th1型免疫反應(yīng)（包括CD8＋T細(xì)胞的產(chǎn)生）[1]；完全弗氏佐劑能誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)，但同時(shí)會(huì)引起注射部位產(chǎn)生長(zhǎng)期的炎癥反應(yīng)及潰瘍[11]；不完全弗氏佐劑作為流感疫苗佐劑能誘導(dǎo)長(zhǎng)效抗體的產(chǎn)生，但也伴有注射部位產(chǎn)生無(wú)菌膿腫的不良反應(yīng)[12]。因此，尋找一種安全有效的佐劑至關(guān)重要。

中草藥多糖因其具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性和低毒性被作為候選疫苗佐劑，如黃芪多糖作為口蹄疫病毒佐劑能顯著增強(qiáng)口蹄疫病毒抗原特異性抗體的產(chǎn)生，并提高干擾素-γ和白細(xì)胞介素-6 mRNA的表達(dá)[13]。枸杞多糖同樣可增強(qiáng)疫苗的免疫效果，促進(jìn)抗OVA特異性體液免疫反應(yīng)以及Th1型細(xì)胞因子（干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α）和Th2型細(xì)胞因子（白細(xì)胞介素-4）的分泌[14]；靈芝多糖作為OVA佐劑能刺激OVA特異性抗體的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生[15]。疫苗與特定佐劑的配伍需要大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，合理選擇佐劑將有助于新型疫苗的發(fā)展。

佐劑的有效性是通過(guò)檢測(cè)其配伍疫苗誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)水平來(lái)評(píng)價(jià)的。本研究選用不同劑量的WCDCP配伍OVA肌內(nèi)注射小鼠進(jìn)行量效關(guān)系的探討。間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定結(jié)果顯示，初次免疫后7 d即產(chǎn)生了OVA特異性IgG抗體，表明WCDCP可快速激起抗體的產(chǎn)生；隨著初次免疫后時(shí)間的延長(zhǎng)（21 d和28 d），WCDCP呈劑量依賴(lài)地提高IgG抗體水平。對(duì)于不同種類(lèi)的感染原需要不同類(lèi)型的免疫反應(yīng)，例如對(duì)細(xì)胞內(nèi)感染需要Th1型免疫反應(yīng)，其特征抗體分型有IgG2a、IgG2b和IgG3；而對(duì)于大多數(shù)細(xì)菌以及某些病毒感染則需要Th2型免疫反應(yīng)，其抗體分型有IgG1。本研究中WCDCP不僅能明顯提高OVA特異性IgG1抗體水平，還能顯著提高OVA特異性IgG2a抗體水平，說(shuō)明WCDCP對(duì)OVA抗原誘導(dǎo)的特異性體液免疫有顯著增強(qiáng)效果，且能促進(jìn)Th1/Th2混合型免疫反應(yīng)。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)初次免疫后21 d各組小鼠脾臟中的CD3＋CD8＋T、CD3＋CD4＋T和CD4＋CD44＋T細(xì)胞比例

T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)在流行病的預(yù)防和控制中起著重要作用[16]。T細(xì)胞分裂和分化后會(huì)分別形成Th細(xì)胞（CD4＋T細(xì)胞）和殺傷性T細(xì)胞（CD8+T細(xì)胞）[17]，進(jìn)而產(chǎn)生效應(yīng)性CD4+CD44+T細(xì)胞和CD8+CD44+T細(xì)胞[18]。本研究首先采用噻唑藍(lán)法檢測(cè)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖情況，刀豆蛋白A刺激結(jié)果顯示中劑量和高劑量WCDCP均可明顯促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，而脂多糖刺激結(jié)果顯示低劑量和高劑量WCDCP均可明顯促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖。進(jìn)一步的流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明，WCDCP能明顯提高小鼠脾臟中CD3+CD4+T細(xì)胞及CD4+CD44+T細(xì)胞的比例，促進(jìn)B細(xì)胞成熟和抗原呈遞；并能明顯提高小鼠脾臟中CD3+CD8+T細(xì)胞和淋巴結(jié)中CD8+CD44+T細(xì)胞的比例，從而在抵抗病原體入侵時(shí)發(fā)揮重要作用[19]。上述研究結(jié)果表明，WCDCP能很好地促進(jìn)T細(xì)胞免疫反應(yīng)，主要表現(xiàn)在WCDCP能提高不同T細(xì)胞亞群的比例。此外，在整個(gè)免疫過(guò)程中觀察并記錄小鼠的生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)WCDCP對(duì)小鼠的正常生長(zhǎng)無(wú)影響。

表1 初次免疫后不同時(shí)間各組小鼠的體質(zhì)量變化（n＝6，g，Mean±SD）

綜上所述，WCDCP能快速激起OVA特異性抗體的產(chǎn)生，提高OVA特異性抗體水平，誘導(dǎo)Th1/Th2混合型免疫反應(yīng)，顯著增強(qiáng)T細(xì)胞免疫反應(yīng)，且對(duì)小鼠生長(zhǎng)無(wú)不良反應(yīng)，是一種安全有效的候選疫苗佐劑。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突