戎曉媛 張玉樓 黃 康 劉 楠 蔚鵬飛

1(中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院 深圳 518055)

2(中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

1 引 言

人類和動物的“基本情感”與生俱來，在物種中廣泛存在，并通過進化高度保守地刻印在大腦中可能存在的本能情感環(huán)路中[1]。目前較為公認的情感分類是 Ekman 在 1972 年提出的六種基本情感理論，包括恐懼、愉悅、悲傷、憤怒、厭惡和驚訝[2]。其中，恐懼情感是個體最必不可少的基本情感：一方面，恐懼情感是物種進化與生存過程中最重要和最不可或缺的基本情緒表征之一，在生存和繁衍中起重要作用；另一方面，在應(yīng)用動物模型的實驗室研究中，恐懼刺激誘發(fā)的防御行為非常穩(wěn)定，實驗范式可靠且容易建立[3]。視覺信息是自然界中一種重要的環(huán)境線索輸入，對動物感知恐懼至關(guān)重要。已有研究表明，果蠅、嚙齒目動物、非人靈長類動物和人類都會對來自上視野的視覺刺激產(chǎn)生本能防御反應(yīng)[4-6]。2013 年，陰影逼近視覺刺激范式被建立并發(fā)現(xiàn)該范式可誘發(fā)小鼠的逃跑或凍結(jié)防御反應(yīng)[7]。運用該范式和光遺傳技術(shù)發(fā)現(xiàn)上丘(Superior Colliculus，SC)腦區(qū)與防御反應(yīng)相關(guān)[8-9]。其中，光激活上丘內(nèi)側(cè)神經(jīng)元可以誘發(fā)凍結(jié)或逃跑的防御行為[10-11]。然而，關(guān)于小鼠面對同類型但不同強度危險刺激(如視覺刺激灰度值大小、光刺激頻率高低)的防御反應(yīng)的差異卻鮮有研究[12]。恐懼神經(jīng)環(huán)路對刺激信號的處理不當或調(diào)節(jié)異常，將會帶來很多與恐懼情緒相關(guān)的病癥，如恐懼癥、焦慮癥、自閉癥、精神分裂癥、創(chuàng)傷后壓力癥和創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等[13-14]。因此，解析恐懼形成背后的大腦相關(guān)機制具有重要意義。

小鼠行為表型主要取決于外界感覺信息輸入的種類和大腦中樞對這些信息的不同處理方式[15]?？蒲腥藛T通常給予小鼠光、圖像、聲音、氣味等刺激，深入解析小鼠行為。雖然現(xiàn)有的小鼠行為分析系統(tǒng)或算法功能已經(jīng)非常強大，能較為準確地分析小鼠多種行為特征變量，但它們均存在一個不足之處，即無法在線實時分析小鼠多種行為特征變量并進行反饋調(diào)節(jié)。因此實驗人員只能在實驗完成后，進行離線視頻分析。但實際情況是，大多數(shù)實驗人員需要在實驗過程中實時分析小鼠的多種行為特征變量，并在它們達到閾值時給予反饋調(diào)節(jié)，從而更好地研究小鼠行為。本文自主研發(fā)的反饋式小鼠行為分析系統(tǒng)，不僅能在線實時分析小鼠質(zhì)心坐標位置、速度、頭部偏轉(zhuǎn)角度、運動狀態(tài)等行為特征變量，還可以在小鼠多種行為特征變量值同時達到閾值時，給予相應(yīng)類型的隨機刺激形成反饋調(diào)節(jié)。該系統(tǒng)刺激種類多樣化，可以更好地滿足實驗人員的需求。實驗人員通過圖形用戶界面就可以方便、可視化地觀察刺激過程中的各種變量，也可以調(diào)節(jié)刺激閾值。當行為特征變量達到設(shè)定閾值時，自動觸發(fā)刺激[16]。反饋式小鼠行為分析系統(tǒng)不僅能在線或離線分析動物的各種行為特征變量，還可以更改反饋式小鼠行為分析系統(tǒng)程序中的參數(shù)值(實驗裝置參數(shù)值、間隔幀數(shù)、時間等)和多種行為變量的閾值，從而滿足不同實驗者的要求，降低系統(tǒng)成本，實現(xiàn)對動物行為的精確分析。同時，該系統(tǒng)還可以實現(xiàn)實驗過程的全自動化。本文利用該反饋式行為分析系統(tǒng)，探索小鼠在不同強度視覺刺激及不同頻率光刺激下的防御行為。

2 方 法

2.1 材料

本文動物實驗方案經(jīng)中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院動物倫理委員會審查通過(受理號為 SIAT-IRB-150302-NS-WLP-A0126-4)。Etv1-CreER 轉(zhuǎn)基因小鼠為中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院培育出的轉(zhuǎn)基因品系，實驗所用小鼠共 34 只，年齡為 8～12 周。動物生存環(huán)境為無特定病原體實驗室，照明周期為 12 h 光照/12 h 黑暗，期間給予充足的飼料和飲水。實驗所用病毒為本實驗室自制 AAV-DIO-ChR2-mCherry，滴度為 2.19×1012，每只小鼠于每個位點注射 500 nL。

2.2 動物手術(shù)實驗

本文動物實驗包括病毒注射、光纖植入、灌流及腦組織固定、腦組織切片及免疫組織化學(xué)觀察。

2.2.1 病毒注射

首先，使用 10% 水合氯醛腹腔麻醉小鼠(注射劑量為 0.04 mL/10 g)，麻醉好之后，采用剪刀去除頭部表面毛發(fā)，并使用立體定位儀固定小鼠，接著使用消毒剪刀剪開頭皮，暴露前囟(Bregma)和后囟(Lambda)。然后，以前囟為坐標原點，后囟(0, 0, 4.24)為參考點建立直角坐標系，通過前囟前后(Anteroposterior，AP)、中縫左右(Mediolateral，ML)、顱骨(硬腦膜)平面向下(Dorsoventral，DV)確定坐標位置。接著，調(diào)節(jié)小鼠顱骨處于同一水平面。最后，調(diào)節(jié)定位儀，確定注射目標腦區(qū)，采用顱鉆打孔后，將預(yù)先吸好病毒的注射針緩慢下降至目標位置，以 100 nL/min 的速度注射病毒。注射結(jié)束后停針10 min，再緩緩將針頭移出，用酒精或碘伏擦拭顱骨，手術(shù)針進行縫合。其中，病毒注射位置坐標為 SC(AP: 3.8 mm, ML: 0.6 mm, DV:－1.7 mm)。

2.2.2 光纖植入

病毒注射 3 周后可植入光纖，重復(fù)病毒注射步驟至確定注射位置后，使用顱鉆打孔，并調(diào)節(jié)立體定位儀，將光纖頭緩慢下降至目標腦區(qū)，再把采用牙科水調(diào)勻的牙科粉涂抹于顱骨表面將光纖頭包埋固定，待其冷卻凝固。其中，光纖植入坐標為 SC(AP: 3.8 mm, ML: 0.5 mm, DV:－1.3 mm)。手術(shù) 1 周后進行行為學(xué)實驗。

2.2.3 灌流及腦組織固定

行為學(xué)實驗后，先將完全麻醉的小鼠四肢固定于實驗臺，手術(shù)剪剪開小鼠胸腔，將灌注針頭插入左心室；然后，剪開右心耳，勻速(20 mL/min)灌注磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buあer Solution，PBS)，待小鼠腦組織中的血液排除干凈，灌注多聚甲醛溶液，對腦組織進行固定；最后，將固定好的鼠腦浸泡于 4% 多聚甲醛溶液固定 1 天，再換 30% 蔗糖溶液脫水 3 天后，將鼠腦包埋并放置于－20 ℃ 或－80 ℃ 備用。

2.2.4 切片及免疫組織化學(xué)觀察

將包埋好的鼠腦置于冰凍切片機并固定在切片機的托盤上，收集目標腦區(qū)的腦片置于含有 PBS 的 24 孔板中。其中，組織切片厚度為 30 μm。采用 PBS 溶液洗滌腦片后貼于載玻片上，封片后使用玻片掃描儀觀察目標腦區(qū)病毒表達情況及確認光纖埋植位置。

2.3 行為學(xué)分析

本研究將統(tǒng)計給予視覺刺激或光刺激后小鼠逃跑所用時間、凍結(jié)時間、在安全區(qū)域里的時間和自由運動時間等。采用反饋式小鼠行為分析系統(tǒng)對同一類型(視覺刺激或光刺激)不同刺激強度下小鼠的防御反應(yīng)進行研究，以此來評估小鼠對于視覺刺激或光刺激的恐懼程度及其采取的反應(yīng)。

2.4 行為學(xué)裝置搭建及系統(tǒng)調(diào)試

反饋式小鼠行為分析系統(tǒng)由行為學(xué)實驗箱、小鼠行為分析系統(tǒng)、隨機刺激系統(tǒng)三部分組成。如圖 1(a)所示，行為學(xué)實驗箱由透明亞克力材料制成，是一個底部直徑為 50 cm 的圓柱形曠場裝置(高 45 cm)。其中一端開口 10 cm 并外接一長為 50 cm 長方體，其底部和側(cè)面均不透明，頂部有可以拆卸的蓋子，用于遮蔽頂部的視覺刺激，可為動物提供一個安全區(qū)域。視覺呈現(xiàn)通過一塊置于行為實驗箱裝置正上方的 42 英寸液晶顯示器實現(xiàn)。在行為實驗箱裝置和液晶顯示器之間，圓柱形曠場裝置正上方 38 cm 處為一個頂部攝像頭，用于拍攝小鼠行為視頻。攝像頭為自行購買的 120°廣角攝像頭，表面積較小(2 cm×2 cm)，保障了在不遮擋顯示器呈現(xiàn)視覺刺激的同時，完整地拍攝小鼠在圓形曠場中的行為視頻，最終攝像頭通過 USB 接口將視頻實時傳輸?shù)叫∈笮袨榉治鱿到y(tǒng)。

為研究小鼠的本能恐懼，需要通過顯示器模擬天敵給予小鼠視覺刺激，進而分析小鼠在視覺刺激下的行為變化。視覺刺激 Looming 范式細節(jié)如圖 1(b)所示，圓盤大小可以用度數(shù)來表示，一半視角度數(shù)的正切值是黑盤半徑與顯示器高度的比值。圖 1(b)顯示，一次完整的刺激中共有 15 次視覺刺激(1 次/s)。其中，在每一次視覺刺激時，黑盤從 0～250 ms 先均勻地從 2°增大到 40°，然后在 40°持續(xù) 250 ms 后消失；顯示器則維持原有亮度 500 ms，隨后進行下一次視覺刺激。依此循環(huán)，直到給予小鼠 15 次視覺刺激后，一次刺激完成。為避免小鼠適應(yīng)環(huán)境從而無法誘發(fā)本能恐懼反應(yīng)，采用隨機的方式給予小鼠視覺刺激。其中，隨機刺激是指隨機給予小鼠灰度值、黑盤大小、頻率、時長等參數(shù)不同的視覺刺激。

反饋式小鼠行為分析系統(tǒng)如圖 1(c)所示，圓柱形曠場上方的攝像頭實時采集小鼠行為視頻流，通過 USB 接口把數(shù)據(jù)傳遞給小鼠行為分析系統(tǒng)——以 Bonsai 可視化編程框架為基礎(chǔ)[17]，搭建的一套自動化動物行為分析系統(tǒng)。該系統(tǒng)能實時分析小鼠質(zhì)心坐標位置、速度、頭部偏轉(zhuǎn)角度等行為特征變量。當小鼠到達實驗人員提前設(shè)定的感興趣區(qū)域，且行為變量達到閾值時，通過串口將小鼠行為特征參數(shù)發(fā)送至隨機刺激系統(tǒng)，待系統(tǒng)收到完整命令后，通過內(nèi)置程序進行串口清零操作，以確保下次行為特征參數(shù)傳遞的準確性。其中，隨機刺激系統(tǒng)包括視覺刺激及隨機序列生成系統(tǒng)和其他刺激生成裝置。實驗人員通過提前在 Matlab 平臺編寫程序，生成含有特定參數(shù)的視覺刺激和光刺激，隨后根據(jù)實驗需要在系統(tǒng)中生成多項刺激命令，同時通過提前編寫隨機函數(shù)，隨機選擇刺激命令并給予小鼠相應(yīng)刺激。隨機視覺刺激通過調(diào)用 Psychtoolbox 工具包，在安裝 Matlab 的電腦上生成并通過 42 英寸液晶顯示器進行顯示。其他刺激通過該系統(tǒng)發(fā)送刺激命令至相應(yīng)刺激生成裝置繼而生成刺激。以光刺激為例，生成裝置采用 Arduino 開發(fā)板接收和處理刺激命令，通過解析刺激命令程序生成對應(yīng)的數(shù)字信號發(fā)送給激光器，使激光器發(fā)出隨機序列對應(yīng)的特定頻率及特定脈沖寬度的激光，并通過光纖刺激小鼠特定腦區(qū)。在給予刺激后，小鼠行為分析系統(tǒng)繼續(xù)捕獲視頻分析小鼠行為變化，同時根據(jù)實驗需要自動或手動更改行為變量閾值形成閉環(huán)反饋。

圖1 小鼠行為分析和隨機刺激系統(tǒng)Fig.1 Mouse behavior analysis and random stimulation system

反饋式小鼠行為分析系統(tǒng)主要通過圖像處理算法對小鼠行為視頻進行分析，進而得到小鼠各種行為特征變量。圖 2(a)為行為分析算法相應(yīng)流程，按照先后順序依次為：①采用圓柱形曠場上方 120°廣角攝像頭拍攝完整的小鼠行為視頻。②對視頻進行視野裁剪操作，剪除視頻中多余的部分。其中，使用圓外切矩形對視頻進行裁剪。這種裁剪方式可以根據(jù)裁剪區(qū)域像素長寬與圓柱形曠場實際半徑的比值，計算出小鼠特征變量值實際大小，如小鼠運動速度和運動軌跡的真實數(shù)值等。③對裁剪區(qū)域視頻進行色彩平衡處理，目的是將小鼠與曠場背景進行分離。④通過平滑去噪處理，消除視頻中的噪聲信號。⑤對視頻進行形態(tài)學(xué)操作，主要為腐蝕和膨脹操作，用來消除視頻中光纖對行為分析的影響，使小鼠身體輪廓更加平滑。⑥對視頻進行自適應(yīng)二值化操作，其中像素值小于閾值的設(shè)為 1，其他像素值設(shè)為 0，從而得到二值化視頻。此時白色小鼠輪廓與黑色背景形成鮮明對比。⑦對視頻進行 Canny 算子邊緣提取，得到較為精確的小鼠身體輪廓，接著尋找視頻中小鼠輪廓的最大聯(lián)通區(qū)域，得到小鼠質(zhì)心，進而得到小鼠質(zhì)心位置坐標。

通過檢測視頻中小鼠身體極大值點，得到小鼠頭部和尾部特征點，通過身體長軸和短軸夾角計算出小鼠頭部偏轉(zhuǎn)角度，如圖 2(b)所示。最終，利用不同幀小鼠質(zhì)心位置坐標間的歐式距離來計算運動速度。本文中，采用 f1表示視頻幀率，fn表示間隔的幀數(shù)；(x1, y1)為前一幀小鼠的質(zhì)心位置坐標，(x2, y2)為間隔 fn幀后小鼠質(zhì)心位置坐標；實驗裝置實際長度為 L1，實際寬度為 W1。對于圓形曠場來說，L1與 W1均為曠場直徑，L3和 W3為經(jīng)過圖像裁剪、去畸變處理之后的裝置像素長和像素寬，則小鼠的運動速度的計算公式為：

結(jié)合速度和不同幀間像素累積和變化對動物凍結(jié)行為、逃跑行為和正常狀態(tài)進行分類。通過小鼠質(zhì)心位置得到小鼠軌跡矩陣，根據(jù)小鼠經(jīng)過相同位置的次數(shù)增加該位置權(quán)重，進而得到小鼠軌跡熱力圖，如圖 2(b)第 1 個熱力圖所示。將小鼠在不同位置的速度大小映射到顏色空間，即可得到小鼠的速度熱力圖，如圖 2(b)第 2 個熱力圖所示。

如圖 2(c)所示，反饋式小鼠行為分析系統(tǒng)主要包括視頻采集、圖像處理、條件限制、串口發(fā)送、實時顯示、刺激、數(shù)據(jù)保存和離線分析等模塊。圓柱形曠場上方攝像頭采集的小鼠行為視頻，經(jīng)過圖像處理模塊對各種圖形進行處理后，得到小鼠多種行為特征變量值，隨后由條件模塊對相應(yīng)特征變量值與預(yù)設(shè)閾值進行大小判斷，如達到閾值則將刺激命令通過串口發(fā)送模塊發(fā)送至刺激模塊，刺激模塊解析命令后給予小鼠相應(yīng)刺激。實驗人員可以通過實時顯示模塊觀察小鼠行為特征變量的變化情況，當刺激后小鼠行為特征變量達到反饋閾值時，系統(tǒng)自動或?qū)嶒炄藛T手動修改刺激參數(shù)值進行反饋調(diào)節(jié)。最終，通過數(shù)據(jù)保存模塊，將動物各種行為特征變量值保存到指定路徑，并采用離線分析模塊對離線視頻進行分析。離線分析模塊由探索區(qū)域、交互分析、狀態(tài)分析和熱力圖模塊組成，其中探索區(qū)域模塊可以根據(jù)小鼠質(zhì)心位置坐標，分析小鼠進入感興趣區(qū)域的次數(shù)和時間。對視頻中圖像進行二值化處理后，背景將變成黑色，而小鼠身體輪廓則變成白色。因此，當小鼠進入感興趣區(qū)域時，該區(qū)域像素累加和將變高。利用統(tǒng)計函數(shù)記錄小鼠位于感興趣區(qū)域的幀數(shù) fn，幀數(shù)與幀率 f1的比值即為小鼠在感興趣區(qū)域時間 t1，即：

圖2 行為分析系統(tǒng)流程圖及行為變量可視化Fig.2 Flow chart of behavior analysis system and visualization of behavior variables

結(jié)合像素累積和與時間閾值關(guān)系，可求得小鼠進入感興趣區(qū)域的次數(shù)。交互分析模塊可以分析曠場中小鼠與籠中小鼠社交的時間和次數(shù)；狀態(tài)分析模塊可以根據(jù)速度和不同幀像素的變化情況，分析小鼠行為狀態(tài)變化，如分析小鼠在刺激前后行為狀態(tài)的變化；熱力圖模塊可以采用圖像處理算法分析小鼠軌跡熱力圖和速度熱力圖。綜上所述，反饋式小鼠行為分析系統(tǒng)能較為全面地分析小鼠行為特征變量，并及時給予反饋調(diào)節(jié)。

本系統(tǒng)將基礎(chǔ)圖像處理算法按照一定的邏輯順序組合起來，實現(xiàn)對小鼠多種行為特征變量的分析，這些算法是其中必不可少的一個環(huán)節(jié)，基于此實現(xiàn)了同時對小鼠多種行為特征變量分析的強大功能。本系統(tǒng)的創(chuàng)新點主要有：(1)與傳統(tǒng)分析系統(tǒng)相比，系統(tǒng)基于攝像頭模組拍攝小鼠行為視頻，完成對小鼠多種行為特征變量的分析，不需要額外的傳感器，成本較低。(2)通過不同幀間的像素距離和實際行為學(xué)實驗箱的尺寸來確定小鼠運動速度，結(jié)合速度和不同幀圖像的像素變化來確定小鼠的運動狀態(tài)(凍結(jié)或逃跑)。(3)通過開發(fā)板編寫的命令解析程序把光刺激命令轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，然后將激光器通過光纖連接到小鼠特定腦區(qū)給予相應(yīng)頻率、時間、脈寬等特征的光刺激。采用開發(fā)板替代價格昂貴的波形發(fā)生器，極大地節(jié)約了成本。(4)雖然傳統(tǒng)小鼠行為分析方法功能很強大，但存在一個共同的缺點是無法對小鼠多種行為特征變量進行實時分析。而與其他傳統(tǒng)小鼠分析軟件和算法相比，本系統(tǒng)最大的優(yōu)點是能夠?qū)崟r低延遲地分析小鼠多種行為特征變量，并在多種行為特征變量同時滿足閾值條件時，給予小鼠多種類型的隨機刺激進行反饋調(diào)節(jié)。

3 實驗結(jié)果

3.1 不同強度視覺刺激誘發(fā)小鼠防御行為

圖3 行為學(xué)裝置示意圖及行為結(jié)果統(tǒng)計圖Fig.3 Schematic diagram of behavior device and statistical graph of behavior results

設(shè)定曠場底部中心半徑 1/2 的同心圓區(qū)域為感興趣區(qū)域，當小鼠進入該區(qū)域且滿足預(yù)設(shè)時間速度等條件時，攝像裝置捕捉上述信息并通過隨機刺激系統(tǒng)觸發(fā)視覺刺激。為改變刺激的強度，本文設(shè)置 5 個灰度值不同的圓盤(25%、45%、60%、75% 和 100%)，由 5°逐漸擴散到 20°，背景灰度值均保持一致，如圖 3(a)所示。將小鼠放入行為學(xué)箱體，隨機不重復(fù)地給予 5 種灰度視覺刺激各一次，記錄并對行為學(xué)進行分析，結(jié)果如圖 3(b～c)所示(n=15)。當視覺刺激強度為 25% 時，小鼠未表現(xiàn)出逃跑反應(yīng)，凍結(jié)小鼠占總數(shù)的 20%(n=3)、自由運動占 80%(n=12)；當刺激強度為 45% 時，凍結(jié)小鼠占 40%(n=6)，較 25% 時上升了 20%，逃跑小鼠占 6.7%(n=1)，自由運動占 53.3%(n=8)；當刺激強度為 60% 時，凍結(jié)小鼠占 4 0%(n=6)，逃跑小鼠占 53.3%(n=8)，自由運動占 6.7%(n=1)；當刺激強度為 75% 時，凍結(jié)小鼠占 26.7%(n=4)，逃跑小鼠占 40%(n=6)，自由運動占 33.3%(n=5)；當刺激強度為 100% 時，凍結(jié)小鼠占 46.7%(n=7)，逃跑小鼠占 40%(n=6)，自由運動占 13.3%(n=2)。這表明，隨著刺激強度的增加，小鼠表現(xiàn)出逃跑或凍結(jié)行為，其中逃跑行為傾向更顯著，自由運動占比降低；而在小鼠視覺刺激強度較低時，僅易誘發(fā)小鼠產(chǎn)生凍結(jié)防御行為。

3.2 不同頻率光刺激誘發(fā)小鼠防御行為

本研究將 AAV-ChR2-mCherry 病毒注射在轉(zhuǎn)基因小鼠上丘腦區(qū)，利用光遺傳學(xué)方法，結(jié)合隨機刺激系統(tǒng)，通過不同頻率的光隨機刺激小鼠 SC 腦區(qū)，對得到的實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用 20 Hz 頻率光刺激瞬間，小鼠均表現(xiàn)出凍結(jié)行為，但因個體差異，凍結(jié)時長從 3～10 s 不等。在 8 次實驗中，僅有 1 次小鼠在凍結(jié) 3 s 后跑回窩。采用 60 Hz 頻率光刺激瞬間，11 次實驗中有 7 次小鼠迅速反應(yīng)逃跑回窩，如圖 4(a)所示。將實驗后的小鼠進行灌流、鼠腦切片處理以驗證病毒表達情況。圖 4(b)顯示，在 SC 腦區(qū)病毒表達良好，表明行為學(xué)實驗有效。當不同頻率的光刺激小鼠時，小鼠表現(xiàn)出不同的行為反應(yīng)，如圖 4(c)所示。其中，低頻刺激更容易誘發(fā)小鼠產(chǎn)生凍結(jié)反應(yīng)(20 Hz 光刺激凍結(jié)時間為(4.818±1.197)s，60 Hz 光刺激凍結(jié)時間為(1.727±0.751 9)s，mean±SEM(均值±標準誤)，P＝0.040 8)；高頻刺激下小鼠更傾向于逃跑(20 Hz 光刺激逃跑時間為(0.090 91±0.090 91)s，60 Hz 光刺激逃跑時間為(0.636 4±0.152 1)s，P＝0.005 9)。此外，高頻刺激下逃跑后小鼠偏向于回窩(20 Hz 光刺激回窩時間為(0.545 5±0.177 2)s，60 Hz 光刺激回窩時間為(5.727±1.369)s，P＝0.002 2)。

圖4 光刺激結(jié)果圖Fig.4 The results of light stimulation

4 討論與分析

傳統(tǒng)的小鼠行為分析中，常用的軟件或算法主要有 3 種：深度傳感器、Any-maze 軟件和紅外傳感器，具體如圖 5 所示。

如圖 5(a)所示，采用低成本深度傳感器從下方捕獲小鼠的形狀，可以在沒有光學(xué)標記或透明地板的情況下捕捉小鼠的足跡和 3D 爪尖位置。該方法的優(yōu)點是能準確地追蹤小鼠的軌跡特征[18]。目前已有研究采用商業(yè)化行為分析軟件，如 Anymaze 軟件(圖 5(b))對小鼠行為進行分析[19]。Any-maze 動物行為分析系統(tǒng)不僅可以用于 Barnes(巴恩斯)迷宮、高架 Zero 迷宮[20-21]、Morris 水迷宮、T-迷宮、Y-迷宮[22]、八臂迷宮[23]和高架十字迷宮[20,24]等各類迷宮的小鼠行為分析，還可以分析圓形曠場和方形曠場中小鼠行為特征變量。該軟件的優(yōu)點是能分析小鼠多種行為特征變量，并且適用實驗裝置范圍廣。但以上兩種方法都存在一個不足，即無法在線實時分析小鼠多種行為特征變量并進行反饋調(diào)節(jié)，實驗人員無法在實驗過程中實時分析小鼠的多種行為特征變量。圖 5(c)所示為使用紅外踏板對小鼠進行行為分析，雖然該方法能實時分析小鼠行為[25]，但它是通過小鼠四肢對紅外光的遮擋來確定小鼠位置，由于小鼠四肢不間斷地在不同位置遮擋紅外光，從而造成所求小鼠位置的不準確。

反饋式小鼠行為分析系統(tǒng)除了能進行離線分析外，相比于傳統(tǒng)方法最大的優(yōu)點是它能實時分析小鼠速度、質(zhì)心位置坐標、軌跡等多種行為特征變量，并且在小鼠多種行為特征變量達到閾值時自動給予反饋調(diào)節(jié)。經(jīng)過人工對位置、距離、速度等多種行為變量進行測量計算，與本系統(tǒng)對多種行為變量分析結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，本系統(tǒng)與人工統(tǒng)計結(jié)果的誤差要遠遠小于不同人員測量結(jié)果間的誤差，證明了本系統(tǒng)的可用性。但在小鼠細節(jié)捕捉方面，本文系統(tǒng)還存在一定的局限性，如尚無法做到在實現(xiàn)實時刺激的基礎(chǔ)上對小鼠行為(如毛發(fā)梳理、肢體伸展、尾巴擺動)進行捕捉并分析。因此，有待進一步提升和完善，使實驗結(jié)果更為精細化。

圖5 傳統(tǒng)動物行為分析方法示意圖Fig.5 Schematic diagram of traditional animal behavior analysis methods

關(guān)于逃跑和凍結(jié)防御行為，大部分研究聚焦于防御行為與神經(jīng)元的關(guān)系。例如，Salay 等[26]發(fā)現(xiàn)腹中線丘腦腦區(qū)的兩類神經(jīng)元分別介導(dǎo)小鼠產(chǎn)生逃跑和凍結(jié)防御行為；Shang 等[10]發(fā)現(xiàn)位于上丘腦區(qū)不同層的同一神經(jīng)元介導(dǎo)不同防御行為。但對同一類型不同強度危險刺激誘發(fā)的防御反應(yīng)鮮有研究。本文基于反饋式動物行為分析系統(tǒng)探討了小鼠在不同灰度值或光刺激頻率刺激時采取的防御行為。其中，給予小鼠不同灰度值的 Looming 視覺刺激，當灰度值較小時，小鼠傾向于凍結(jié)，在躲避捕食者的同時最大程度保存體力；當灰度值較大時，危險系數(shù)增大，小鼠逃跑比例上升。采用光遺傳學(xué)激活小鼠上丘腦區(qū)神經(jīng)元，當光刺激頻率較低時，小鼠趨向于原地凍結(jié)；當光刺激頻率較高時，小鼠會采取迅速逃跑至安全區(qū)域的防御行為。雖然小鼠對同種類型不同強度的刺激表現(xiàn)出不同的防御反應(yīng)，但其具體神經(jīng)機制和調(diào)控機理尚未清楚——不同防御反應(yīng)的產(chǎn)生是由于上丘腦區(qū)神經(jīng)元投射的不同而形成不同神經(jīng)環(huán)路，還是上丘腦區(qū)內(nèi)部一類或幾類神經(jīng)元構(gòu)成了微環(huán)路，進而介導(dǎo)不同的防御反應(yīng)，均有待進一步研究。

5 總 結(jié)

本文提出一種自主研發(fā)的反饋式小鼠行為分析系統(tǒng)。與其他軟件和算法相比，該系統(tǒng)可以實時分析小鼠多種行為特征變量，給予小鼠多種類型的隨機刺激并能進行反饋調(diào)節(jié)，實現(xiàn)了小鼠行為學(xué)實驗的全自動化操作。通過該系統(tǒng)對同一類型不同刺激強度下小鼠的防御行為進行研究發(fā)現(xiàn)，在低強度的危險刺激(低灰度值、低光刺激頻率)時，小鼠傾向于原地凍結(jié)；在高強度的危險刺激(高灰度值、高光刺激頻率)時，小鼠趨向于逃跑至安全區(qū)域。這表明，反饋式小鼠行為分析系統(tǒng)可以實現(xiàn)小鼠行為調(diào)控和分析的自動化，節(jié)約成本的同時提高了實驗效率和準確性，也豐富了動物行為學(xué)研究工具庫。此外，本研究發(fā)現(xiàn)不同強度的刺激會誘發(fā)小鼠產(chǎn)生相應(yīng)的防御行為，加深了對大腦恐懼相關(guān)機制的理解，可為恐懼相關(guān)疾病治療提供理論依據(jù)。