王雅軒，李冰潔，崔抗，余樸，馬望

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052

鴉膽子為苦木科（Simaroubaceae）鴉膽子屬（Brucea J.F.Miller）植 物 鴉 膽 子 [Brucea javanica（Linnaeus）Merrill]的干燥成熟果實(shí)，又名老鴉膽、苦參子和鴉蛋子，主產(chǎn)于我國廣東、廣西、海南、云南、福建和臺灣等地。鴉膽子化學(xué)成分非常復(fù)雜，其研究始于上世紀(jì)60年代初，迄今為止，已從鴉膽子種子和全草中分離鑒定了150多個(gè)化合物，其中主要包括苦木內(nèi)脂類、黃酮類、蒽醌類、三萜類、甾體類、脂肪酸類、倍半萜類等化合物[1]。我國于1978年開始研制鴉膽子油靜脈乳劑，并用于各種惡性腫瘤包括食管癌的治療[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子油乳與其他抗癌藥共用時(shí)，有一定的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，可以增強(qiáng)其他藥物對耐藥細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[5]。然而，鴉膽子抗食管癌的特定機(jī)制和有效單體尚不明確。本研究利用生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，結(jié)合中藥治療疾病具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)，對鴉膽子治療食管癌的靶點(diǎn)及作用機(jī)制進(jìn)行了分析，為鴉膽子應(yīng)用于食管癌臨床提供理論依據(jù)，并為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用提供思路。

1 材料與方法

1.1 鴉膽子有效成分及靶點(diǎn)的篩選

使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）進(jìn)行鴉膽子有效成分及靶點(diǎn)的篩選[6]。TCMSP是一種獨(dú)特的中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺，其包含了499味草藥（中國藥典2010版）以及每位草藥的化合物成分（共計(jì)29000余個(gè)），并能捕捉藥物、靶標(biāo)和疾病之間的關(guān)系。在獲得了有效成分以后，我們又以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%和類藥性（druglikeness，DL）≥0.18為篩選條件[7]，對鴉膽子的活性成分進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。

1.2 食管癌相關(guān)靶點(diǎn)的提取

利用 GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）進(jìn)行食管癌相關(guān)靶點(diǎn)的提取。GeneCards是一個(gè)包含了150個(gè)網(wǎng)絡(luò)來源的以基因?yàn)橹行牡臄?shù)據(jù)的集成數(shù)據(jù)庫，包括基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、遺傳、臨床和功能信息，提供所有有關(guān)注釋和預(yù)測人類基因的全面信息。OMIM數(shù)據(jù)庫中包含有關(guān)所有已知孟德爾疾病和超過15 000個(gè)基因的信息，其關(guān)注于表型和基因型之間的關(guān)系。我們把從兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中獲得的相關(guān)靶基因取并集，得到食管癌相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 “有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將鴉膽子有效成分的靶點(diǎn)和食管癌相關(guān)靶基因取交集，得到共同靶點(diǎn)基因。使用Cytoscape 3.7.1軟件，利用所得到的交集基因做出“有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖[8]。該網(wǎng)絡(luò)圖可以展示出鴉膽子有效成分和食管癌基因之間的關(guān)系。

1.4 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein protein interaction network，PPI network）的構(gòu)建

使用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）構(gòu)建靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)。STRING數(shù)據(jù)庫是一個(gè)搜索已知蛋白質(zhì)和預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫，包括了直接的物理作用和簡介的功能相關(guān)性。我們使用STRING數(shù)據(jù)庫來觀測靶基因蛋白之間的相互作用關(guān)系，并找出更為關(guān)鍵的核心基因。

1.5 富集分析

為了進(jìn)一步的研究靶基因的分子機(jī)制，我們進(jìn)行了基因本體論（Gene Ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）分析。GO功能分析可以從功能、生物途徑、細(xì)胞功能的角度對基因產(chǎn)物進(jìn)行簡單注釋[9]。KEGG通路富集分析是一個(gè)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的綜合數(shù)據(jù)庫，其中包含了基因的通路信息。其截?cái)噼b定標(biāo)準(zhǔn)均為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 鴉膽子成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果

通過使用TCMSP篩選出鴉膽子已知有效成分67種，通過OB≥30%、DL≥0.18條件進(jìn)行篩選，獲得15個(gè)符合條件的有效成分（表1），其對應(yīng)40個(gè)靶基因。

2.2 食管癌靶基因的獲取

我們在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中分別獲取了與食管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因靶點(diǎn)，取其交集，共有7 092個(gè)。

2.3 藥物-疾病靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

將44個(gè)鴉膽子有效成分靶基因和7 092個(gè)食管癌靶基因取交集，獲得38個(gè)同時(shí)存與鴉膽子和食管癌相關(guān)的基因，對應(yīng)了2種鴉膽子的有效成分，分別為木犀草素及β-谷固醇。我們使用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建鴉膽子與食管癌相關(guān)的“有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。

表1 鴉膽子主要成分基本信息Table 1 Basic information of main components of Brucea javanica

圖1 鴉膽子與食管癌相關(guān)的“有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 Network diagram of“active ingredientstargets”related to Brucea javanica and esophageal cancer

2.4 靶蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)分析

把我們獲得的38個(gè)同時(shí)與鴉膽子和食管癌相關(guān)的靶基因利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2）。圖3展示的是靶基因蛋白之間的交互次數(shù)情況，其中次數(shù)越多，意味著靶基因在PPI網(wǎng)絡(luò)中起到更加關(guān)鍵的作用。由圖可知，PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的核心 基 因 為 EGFR、 CASP3、 CCND1、 VEGFA、ERBB2、IL6。

圖2 鴉膽子作用于食管癌的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 PPI network diagram of Brucea javanica acting on esophageal cancer

圖3 靶基因蛋白交互情況圖Figure 3 Target gene protein interaction diagram

2.5 GO功能分析

我們利用R軟件，對38個(gè)鴉膽子和食管癌的交集靶基因進(jìn)行了GO功能分析。共富集到了55個(gè)功能（P＜0.05），按P值從小到大排序前20個(gè)功能的情況見表2、圖4。圖表結(jié)果顯示，鴉膽子化合物主要富集的功能包括：泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、乙酰膽堿受體活性、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、BH域綁定、類固醇激素受體活性、半胱氨酸型肽酶活性染色質(zhì)結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、死亡受體結(jié)合、內(nèi)肽酶活性、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶調(diào)節(jié)劑活性、激素結(jié)合、磷脂酰肌醇磷脂酶C活性。

2.6 KEGG通路富集分析

我們對38個(gè)基因做了KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示富集到了98條通路上（P＜0.05）。按P值從大到小排序前20條通路的情況見表3、圖5。圖表結(jié)果顯示，鴉膽子化合物主要富集的通路包括：前列腺癌、乙型肝炎、人巨細(xì)胞病毒感染、EB病毒感染、鉑耐藥、PI3K-Akt信號通路、凋亡-多種類、軍團(tuán)菌病、細(xì)胞凋亡、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE信號通路、膀胱癌、p53信號通路、胰腺癌、甲型流感、麻疹、小細(xì)胞肺癌、丙型肝炎、非小細(xì)胞肺癌、HIF-1信號通路。

3 討論

《本草綱目拾遺》中記載“鴉膽子，出閩、廣，藥肆中皆有之。形如梧子，其仁多油，生食令人吐，作霜，捶去油，入藥佳”，并提出鴉膽子具有清熱解毒、截瘧、止痢、腐蝕贅疣的功效[10]。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，鴉膽子也被廣泛應(yīng)用，尤其在抗腫瘤領(lǐng)域。其提取物鴉膽子油乳具有抗癌譜廣、毒性低、效果好等諸多優(yōu)點(diǎn)，且已廣泛用于多癌種的研究及治療[11]。在一項(xiàng)鴉膽子油乳注射液對晚期肝癌患者的臨床療效研究中顯示，其在晚期肝癌的治療方面發(fā)揮重要作用，具有應(yīng)用前景和研究價(jià)值[12]。在食管癌的治療方面，有研究表明在食管癌同步放化療的過程中聯(lián)合運(yùn)用鴉膽子油乳注射液，可減輕放化療治療的毒副反應(yīng)，提高患者的生存質(zhì)量[4]。

表2 鴉膽子治療食管癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)功能信息Table 2 Key target function information of Brucea javanica in the treatment of esophageal cancer

圖4 GO功能分析柱狀圖Figure 4 GO function analysis histogram

表3 鴉膽子治療食管癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)富集通路信息Table 3 Key target enrichment pathway information of Brucea javanica in the treatment of esophageal cancer

圖5 鴉膽子治療食管癌的關(guān)鍵通路Figure 5 Key pathways of Brucea javanica in the treatment of esophageal cancer

表皮生長因子受體（pidermal growth factor receptor，EGFR）為表皮生長因子受體，屬于受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTKs）的酪氨酸激酶受體（ErbB）家族，在細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，它常在癌癥發(fā)生時(shí)突變或過表達(dá)，目前也為多種抗癌藥物的靶點(diǎn)基因之一[13-15]。半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，CASP3）激活在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起著核心作用，其突變與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)[16]。細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1，CCND1）的蛋白產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，其突變、擴(kuò)增和過表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[17]。血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）的上調(diào)可促進(jìn)腫瘤組織的血管生成，也可以影響腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的功能[18]。已有研究表明，酪氨酸激酶受體2（ERBB2）的擴(kuò)增存在于15%～17%的食管癌中，其激活與食管癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL6）是由多種類型的細(xì)胞產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，其與炎性疾病及腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)，大量數(shù)據(jù)顯示其抑制劑可以治療炎性疾病及抑制癌細(xì)胞增殖[20]。我們猜測鴉膽子通過其含有的有效成分木犀草素及β-谷固醇，來調(diào)節(jié)EGFR、CASP3、CCND1、VEGFA、ERBB2、IL6等靶點(diǎn)的表達(dá)或抑制其突變，從而達(dá)到抑制食管癌生長的作用。這也表明了鴉膽子通過多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)治療食管癌。

鴉膽子活性成分與食管癌交集的靶基因的GO功能富集分析結(jié)果主要包括泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、乙酰膽堿受體活性、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、BH域綁定、類固醇激素受體活性、半胱氨酸型肽酶活性染色質(zhì)結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、死亡受體結(jié)合、內(nèi)肽酶活性、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶調(diào)節(jié)劑活性、激素結(jié)合、磷脂酰肌醇磷脂酶C活性等。

在KEGG通路富集分析中發(fā)現(xiàn)，鴉膽子治療食管癌的主要通路有前列腺癌、乙型肝炎、人巨細(xì)胞病毒感染、EB病毒感染、鉑耐藥、PI3K-Akt信號通路、凋亡-多種類、軍團(tuán)菌病、細(xì)胞凋亡、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、膀胱癌、p53信號通路、胰腺癌、甲型流感、麻疹、小細(xì)胞肺癌、丙型肝炎、非小細(xì)胞肺癌、HIF-1信號通路。其中，PI3K-Akt信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、生長、增殖、血管生成、轉(zhuǎn)錄、翻譯和代謝中起著至關(guān)重要的作用[21]，可以調(diào)節(jié)食管癌的發(fā)生與發(fā)展。p53信號通路在調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡表達(dá)等方面發(fā)揮著重要作用[22]，有研究表明通過調(diào)節(jié)p53信號通路可以抑制食管癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞周期G0/G1時(shí)期停滯[23]。HIF-1信號通路可由腫瘤內(nèi)缺氧的激活，其過表達(dá)與包括食管癌在內(nèi)的腫瘤轉(zhuǎn)移和較差的預(yù)后密切相關(guān)[24，25]。由通路富集分析可知，鴉膽子有效成分靶基因富集到的通路主要通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、腫瘤內(nèi)血管生成來影響食管癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后。

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物信息學(xué)，研究了鴉膽子治療食管癌的作用機(jī)制。我們通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析聚焦核心基因，通過富集分析進(jìn)一步分析其作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，中藥鴉膽子對食管癌的治療可通過多種有效成分及與食管癌相關(guān)靶基因和通路產(chǎn)生作用。本研究仍存在一些不足，如數(shù)據(jù)均從公開數(shù)據(jù)庫獲取，可能會存在內(nèi)容更新不及時(shí)及數(shù)據(jù)篩選不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)。本研究結(jié)論還需臨床及實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證。