王朋輝，吳耀松，尚藝婉，孟丹華，李晨旭，李迎霞，楊聯(lián)河，陳玉龍

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.洛陽市中醫(yī)院，河南 洛陽 471000

食管癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率在全球居第七位和第六位。我國每年約有26萬食管癌新發(fā)病例。食管癌預(yù)后欠佳，五年生存率不到30%[1，2]。因此，深入研究食管癌發(fā)生發(fā)展分子機制，可為食管癌治療提供思路及新靶點。目前，越來越多的學(xué)者在食管癌的診療中不僅關(guān)注食管癌細胞本身，更關(guān)注食管癌腫瘤微環(huán)境。腫瘤相關(guān)成纖維性細胞參與了腫瘤發(fā)展全過程，為食管癌細胞的增殖、侵襲等提供了適宜環(huán)境[3，4]。行氣化痰法及其代表方啟膈散在食管癌的治療中運用廣泛，本課題組前期研究顯示啟膈散聯(lián)合順鉑有較顯著的協(xié)同作用，能明顯抑制食管癌EC9706細胞生長，促進食管癌EC9706細胞凋亡及增加S期的阻滯率[5，6]，但在與成纖維細胞共培養(yǎng)條件下啟膈散是否仍具有很好的抑制食管癌細胞生長及與順鉑協(xié)同作用，仍未有相關(guān)研究報導(dǎo)。本文就此問題進行了研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料

1.1 細胞株

食管癌EC9706細胞株由河南省方證信號傳導(dǎo)重點實驗室惠贈，人食管成纖維細胞HEF購自美國ScienCell細胞庫（貨號：#2730）

1.2 主要試劑

DMEM：F12=1∶1（中國 Boster公司批號20160522）、胎牛血清（美國Gemini公司，批號：A97E00G）、順鉑（美國Sigma公司，批號MKBG8465V），Annexin V-FITC/PI細胞雙染凋亡檢測試劑盒、PI周期試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器設(shè)備

倒置顯微鏡（德國Laica公司）、高壓滅菌鍋（日本ALP公司）、低速離心機（湖南湘儀有限公司）、ELx-800型酶標(biāo)儀（美國BIO-TEK公司）、超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)公司）、CO2培養(yǎng)箱德國（Eppendorf公司）、FACSVantage SE型流式細胞儀（美國BD公司）、高速低溫離心機（美國Thermo公司）、紫外分光光度計（美國Thermo）。

2 方法

2.1 藥物制備

實驗藥物啟膈散參照《醫(yī)學(xué)正傳》組方，藥物組成與比例：丹參︰沙參︰茯苓︰川貝母（去心）︰杵頭糠︰砂仁殼︰郁金質(zhì)量比為6︰6︰2︰3︰1︰1︰1；藥材均購自北京同仁堂。藥量按照上述比例稱取每味藥的對等克數(shù)，質(zhì)量︰體積=1︰10，加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡7 d，每日震蕩2次混勻。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮藥液，上述濃縮液與乙酸乙酯體積比為2︰1進行萃??；然后濃縮、低溫真空干燥，最終出膏率為0.82%。二甲基亞砜（DMSO）充分溶解配置100 mg/mL的母液，0.22 μm過濾除菌，-20℃冰箱保存，備用。

2.2 細胞培養(yǎng)

將成纖維HEF和食管癌EC9796細胞于含10%胎牛血清的DMEM：F12=1︰1完全培養(yǎng)基。于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液、傳代。

2.3 啟膈散和順鉑及兩者聯(lián)合對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞增殖的影響

將食管癌EC9706細胞以6×104/孔接種于24孔Transwell細胞培養(yǎng)板下室，成纖維細胞HEF以3×104/孔接種于24孔Transwell細胞培養(yǎng)板上室，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置4h后將上室置于下室中，同時設(shè)置常規(guī)單獨EC9706細胞培養(yǎng)組，每組3個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，MTT（MTT溶液終濃度：0.5 mg/mL），500 μL/孔，37 ℃CO2培養(yǎng)箱中避光孵育4h，吸出上清，加入DMSO（600 μL/孔）緩慢搖床搖動15 min，酶標(biāo)儀570 nm處測吸光度OD值。實驗重復(fù)3次。

以上條件，經(jīng)濃度為10、20、40、80、160 μg/mL啟膈散乙酸乙酯提取物或0.5、1、2、4、8 μg/mL的順鉑處理48 h后，MTT比色法檢測不同培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞對順鉑敏感性，概率法分別計算IC30及IC50值，。

啟膈散和順鉑聯(lián)合用藥，分為單獨順鉑IC30作用48h組，單獨啟膈散乙酸乙酯IC30作用48 h組，聯(lián)合用藥組（順鉑IC30先作用24 h后，再加入啟膈散乙酸乙酯IC30作用24 h）。

2.4 PI染液法檢測細胞周期

取常規(guī)培養(yǎng)對數(shù)生長期細胞，以3×106/瓶接種于10 cm2細胞瓶中，經(jīng)不含血清的培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)24 h。進行共培養(yǎng)和常規(guī)單獨培養(yǎng)，條件如上，藥物濃度同上。培養(yǎng)48 h后，收集食管癌細胞，PI染色30 min，過濾后流式細胞儀檢測細胞周期。

2.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡

細胞培養(yǎng)及分組同2.4。培養(yǎng)48h后，收集食管癌細胞1×106mL-1，預(yù)冷的PBS洗2遍。細胞重懸于 500 μL BufferA 中，加入 5 μL PI和 5 μL Annexin V-FITC染液染色，室溫孵育10～15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。凋亡率=處理組-對照組。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)性分布，采用ANOVA方差分析，數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 啟膈散乙酸乙酯對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞活性影響（n=3，±s）

不同濃度啟膈散乙酸乙酯部位提取物對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞有明顯的抑制作用和量效關(guān)系，成濃度劑量依賴性（P＜0.05）。

表1 啟膈散乙酸乙酯對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞活性影響（n=3，±s）Table 1 Effect of ethyl acetate extract of Qiqe Powder on EC9706 cell activity of esophageal carcinoma under co-culture conditions（n=3，±s）

表1 啟膈散乙酸乙酯對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞活性影響（n=3，±s）Table 1 Effect of ethyl acetate extract of Qiqe Powder on EC9706 cell activity of esophageal carcinoma under co-culture conditions（n=3，±s）

注：與單獨EC9706空白對照組比較，①P＜0.05

組別抑制率（%）0-4.03 24.45 26.90 44.66 69.15啟膈散乙酸乙酯（μg/mL）0 10 20 40 80 160 24 h OD值48 h OD值1 2 3 4 5 6 0.83±0.01 0.79±0.02①0.76±0.05①0.67±0.02①0.45±0.15①0.27±0.07①抑制率（%）0 4.82 8.43 19.28 45.79 67.47 0.88±0.09 0.84±0.14 0.66±0.11①0.62±0.10①0.47±0.05①0.26±0.01①

圖1 啟膈散乙酸乙酯對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞活性影響Figure 1 Effect of ethyl acetate extract of Qiqe Powder on EC9706 cell activity of esophageal carcinoma under co-culture

3.2 與成纖維細胞HEF共培養(yǎng)影響食管癌細胞EC9706對順鉑的敏感性

在順鉑相同濃度作用下，共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706組的OD值明顯高于單獨培養(yǎng)食管癌EC9706組（P＜0.05）；單獨培養(yǎng)IC50為2.63±0.38，共培養(yǎng)為3.41±0.33，共培養(yǎng)條件下順鉑的IC50值明顯高于單獨培養(yǎng)食管癌EC9706組（P＜0.05）。結(jié)果見圖2。

表2 不同培養(yǎng)條件下順鉑對食管癌EC9706的增殖抑制作用（n=3，±s）Table 2 Inhibitory effect of cisplatin on proliferation of esophageal carcinoma EC9706 under different culture conditions（n=3，±s）

表2 不同培養(yǎng)條件下順鉑對食管癌EC9706的增殖抑制作用（n=3，±s）Table 2 Inhibitory effect of cisplatin on proliferation of esophageal carcinoma EC9706 under different culture conditions（n=3，±s）

注：與EC9706空白對照組比較，①P＜0.05；與單獨EC9706培養(yǎng)條件組比較，②P＜0.05；A：單獨EC9706組B：共培養(yǎng)條件組。

順鉑濃度（μg·mL-1）0 0.25 0.5 A組順鉑IC50 B組順鉑IC50 A組OD值0.48±0.06 0.46±0.02 0.44±0.07 0.38±0.12①0.27±0.02①0.08±0.01①B組OD值0.47±0.04 0.50±0.06 0.44±0.05①0.44±0.06①0.31±0.02①0.16±0.01①2.63±0.383.41±0.33②1 2 4

圖2 ：不同培養(yǎng)條件下順鉑對食管癌EC9706的增殖抑制作用（n=3，±s）Figure 2 Inhibitory effect of cisplatin on proliferation of esophageal carcinoma EC9706 under different culture conditions（n=3，±s）

3.3 啟膈散乙酸乙酯聯(lián)合順鉑對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞的抑制作用

與單獨順鉑IC30作用48 h組相比較，聯(lián)合用藥組OD值明顯減少（P＜0.05），聯(lián)合用藥有協(xié)同作用趨勢，順鉑組、啟膈散組、聯(lián)合用藥組對EC9706細胞的抑制率分別為22.97%、33.76%、46.35%。結(jié)果見表3

3.4 啟膈散乙酸乙酯聯(lián)合順鉑對食管癌細胞EC9706的凋亡影響

與單獨培養(yǎng)的EC9706組相比較，共培養(yǎng)條件組總凋亡率降低，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），晚期凋亡率下降明顯；與共培養(yǎng)模型組相比較，順鉑組明顯使EC9706早期凋亡率增加，而啟膈散乙酸乙酯組，聯(lián)合用藥組均使EC9706晚期凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中以聯(lián)合用藥組使EC9706晚期凋亡率增加明顯（P＜0.05），但早期凋亡率差異不大，結(jié)果見表4，圖4、6。

表3 啟膈散乙酸乙酯聯(lián)合順鉑對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞的抑制作用（n=3，±s）Table 3 Inhibitory effect of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture condition（n=3，±s）

表3 啟膈散乙酸乙酯聯(lián)合順鉑對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞的抑制作用（n=3，±s）Table 3 Inhibitory effect of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture condition（n=3，±s）

注：與單獨EC9706空白對照組比較，①P＜0.05

組別空白對照組順鉑組啟膈散組聯(lián)合用藥組OD值0.94±0.01 0.72±0.02①0.62±0.08①0.51±0.06①抑制率（%）0 22.97 33.76 46.35

圖3 啟膈散乙酸乙酯聯(lián)合順鉑對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞的抑制作用Figure 3 Inhibitory effect of ethyl acetate extract of Qige Powder and cisplatin on esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture conditions

3.5 啟膈散乙酸乙酯聯(lián)合順鉑對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞周期的影響

與單獨的EC9706組相比較，共培養(yǎng)模型組增加了S期的比例，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與共培養(yǎng)模型組相比較，順鉑組，啟膈散乙酸乙酯組及聯(lián)合用藥組明顯降低了EC9706細胞G0/G1期的比例，而增加了EC9706細胞S期的比例，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中以聯(lián)合用藥組作用最明顯（P＜0.05）；結(jié)果見表5，圖5、7。

4 討論

在食管癌腫瘤微環(huán)境中，食管癌相關(guān)成纖維細胞中大量分泌的平滑肌激動蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子、IL-6，具有明顯的促進腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展的作用，能夠促進食管癌細胞增殖及侵襲，其分子機制可能與食管癌耐藥有關(guān)[7，8]。

表4 啟膈散乙酸乙酯聯(lián)合順鉑對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞凋亡的影響（n=3，±s）Table 4 Effect of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on apoptosis of esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture condition（n=3，±s）

表4 啟膈散乙酸乙酯聯(lián)合順鉑對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞凋亡的影響（n=3，±s）Table 4 Effect of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on apoptosis of esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture condition（n=3，±s）

注：與單獨EC9706組比較，①P＜0.05；與共培養(yǎng)條件模型組相比較，②P＜0.05

Control M D C CD2總凋亡率（%）33.51±3.11 21.04±8.03①35.30±12.89①②37.35±3.89②55.52±6.12②組別單獨EC9706組共培養(yǎng)條件組順鉑組啟膈散乙酸乙酯組聯(lián)合用藥組早期凋亡率（%）7.05±1.86 4.68±1.05 11.93±2.04②5.96±0.84 5.94±1.67晚期凋亡率（%）26.46±5.27 16.36±7.73 23.36±12.26 31.39±3.03②49.45±4.44②

圖4 啟膈散乙酸乙酯聯(lián)合順鉑對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞凋亡的影響Figure 4 Ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on the influence of culture conditions of esophageal EC9706 cell apoptosis

圖5 啟膈散乙酸乙酯聯(lián)合順鉑對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞周期的影響Figure 5 Influence of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on the cell cycle of esophageal carcinoma EC9706 under co-culture conditions

表5 啟膈散乙酸乙酯聯(lián)合順鉑對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞周期的影響（n=3，±s）Table 5 Influence of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on EC9706 cell cycle of esophageal carcinoma under co-culture conditions（n=3，±s）

表5 啟膈散乙酸乙酯聯(lián)合順鉑對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞周期的影響（n=3，±s）Table 5 Influence of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on EC9706 cell cycle of esophageal carcinoma under co-culture conditions（n=3，±s）

注：與單獨EC9706組比較，①P＜0.05；與共培養(yǎng)條件模型組相比較，②P＜0.05。

Control M D C CD2 S期（%）33.53±3.30 35.08±1.70①50.01±6.71②67.58±6.71②76.58±1.07②組別單獨EC9706組共培養(yǎng)條件組順鉑組啟膈散組聯(lián)合用藥組G0/G1期（%）53.68±3.50 54.01±1.02 34.30±2.29②21.78±2.52②13.14±5.10②G2/M期（%）12.79±2.11 10.92±0.81 15.69±5.20 11.64±1.71 10.01±3.38

本文研究顯示，食管成纖維細胞可以促進食管癌細胞增殖，是否也可降低食管癌細胞對順鉑的敏感性，有待探究。本研究比較了單獨培養(yǎng)食管癌EC9706和成纖維細胞HEF與EC9706共培養(yǎng)條件下兩種不同培養(yǎng)方式對順鉑的敏感性作用異同。發(fā)現(xiàn)在順鉑相同濃度作用下，共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706組的OD值明顯高于單獨培養(yǎng)食管癌EC9706組，說明在共培養(yǎng)條件下成纖維細胞HEF介導(dǎo)了食管癌EC9706的耐藥，降低了順鉑對食管癌EC9706細胞的敏感性，但其機制需要深入研究。

圖6 啟膈散乙酸乙酯聯(lián)合順鉑對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞凋亡的影響Figure 6 Effects of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on apoptosis of esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture conditions

圖7 啟膈散乙酸乙酯聯(lián)合順鉑對共培養(yǎng)條件下食管癌EC9706細胞周期的影響Figure 7 Effects of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on the cell cycle of esophageal carcinoma EC9706 under co-culture conditions

中醫(yī)藥有逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥和增加化療藥物敏感性的作用，而啟膈散聯(lián)合化療可以起到增效減毒效應(yīng)[9，10]。我們前期研究顯示，在常氧和低氧情況下啟膈散聯(lián)合順鉑有明顯的協(xié)同作用，能明顯抑制食管癌EC9706細胞生長[5，6]。本文研究顯示，啟膈散乙酸乙酯部位聯(lián)合順鉑可以更好地抑制與成纖維細胞共培養(yǎng)條件下腫瘤細胞生長，具有一定協(xié)同作用。

細胞凋亡障礙、凋亡抑制都會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，因此直接誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡或通過拮抗凋亡抑制因子來誘導(dǎo)凋亡都是治療腫瘤很好的切入點，包括啟膈散在內(nèi)的許多中藥方劑也具有一定誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作用[11-13]。本實驗結(jié)果顯示，與單獨培養(yǎng)的食管癌EC9706組相比較，共培養(yǎng)條件組下調(diào)了總的凋亡率，以下調(diào)晚期凋亡率較為明顯。啟膈散聯(lián)合順鉑比順鉑單獨應(yīng)用時凋亡率明顯升高，啟膈散在一定程度上能夠增強順鉑誘導(dǎo)EC9706凋亡的能力，但是其機制還需后續(xù)實驗來進行探討。

細胞周期是細胞完成一次完整的有絲分裂的過程，主要分為間期G1期（前期準(zhǔn)備合成DNA單倍體期）、S期（DNA合成期）、G2期（合成蛋白質(zhì)完成DNA復(fù)制的二倍體期）、有絲分裂期M期和靜息狀態(tài)G0期。腫瘤細胞存在周期調(diào)節(jié)失衡，很多研究都有報道中藥可以通過調(diào)節(jié)細胞周期起到治療腫瘤中作用[11，14，15]。本研究顯示，與單獨的EC9706組相比較，共培養(yǎng)模型組上調(diào)了S期的比例，使細胞增殖更快。順鉑組，啟膈散乙酸乙酯組及聯(lián)合用藥組明顯降低了EC9706細胞G0/G1期的比例，而增加了EC9706細胞S期的比例。說明在S期受到了藥物阻滯的影響。因此，啟膈散乙酸乙酯部位增強EC9706細胞對順鉑的敏感性與該結(jié)果有關(guān)。

本研究結(jié)果提示，啟膈散可抑制與成纖維細胞共培養(yǎng)條件下的食管癌細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡，干預(yù)細胞周期，與順鉑聯(lián)合應(yīng)用，具有一定增效作用。