劉曉潔，李永梅，霍峻鋒，趙勁竹，董亞龍，周凱瑞，張雪燕，李蕾蕾，王淙

1.鄭州大學藥物研究院，河南 鄭州 450001；2.濱州醫(yī)學院煙臺附屬醫(yī)院，山東 煙臺 264000；3.河南省新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000

食管癌是一種消化道惡性腫瘤，其惡性程度高，在全球范圍內(nèi)惡性腫瘤死亡人數(shù)中排第六位[1]。多數(shù)患者在確診時就已經(jīng)是晚期，食管癌的五年生存率不足30%[2]。目前，化療是食管癌的主要治療手段之一。

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）具有廣泛的抗腫瘤活性，對卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌和食管癌等惡性腫瘤的早期治療具有一定的效果[3，4]。臨床常用PTX治療食管癌，但其具有較強的毒副作用并易產(chǎn)生耐藥性。因此，聯(lián)合用藥成為近年來研究的熱點。但聯(lián)合用藥也可能會產(chǎn)生一定的拮抗作用。研究發(fā)現(xiàn)，在某些惡性腫瘤中，白藜蘆醇聯(lián)用紫杉醇具有協(xié)同作用[5，6]。白藜蘆醇（Resveratrol，Res）在結(jié)構(gòu)上類似于二苯乙烯，是一種多酚類植物抗毒素，存在于多種植物和草藥中，如葡萄、藍莓、桑葚、花生、虎杖等[7]。其具有多種藥理學和生理學活性，包括抑制腫瘤、心血管保護作用、減少血小板凝集以及化學預防作用[8-11]。目前，有部分臨床醫(yī)生鼓勵患者服用含有白藜蘆醇的膳食補充劑或食物以提高整體的藥物療效。在臨床治療中，許多天然化合物與藥物同時使用后，可以改變藥物外排轉(zhuǎn)運體特性從而影響藥代動力學。本課題主要探究白藜蘆醇對紫杉醇抗腫瘤作用的影響，以期為臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞以及主要試劑

PTX和Res購自海南康力制藥有限公司。二甲基亞砜（DMSO）和核糖核酸酶購自索萊寶（中國北京）。溴化噻唑藍四氮唑（MTT），羅丹明123（Rh123）和碘化丙啶（PI）購自Sigama（美國密蘇里州圣路易斯市）。Hoechst 33258（雙苯酰亞胺）購自碧云天公司。食管癌EC109細胞購自中科院上海細胞庫。

1.2 細胞培養(yǎng)

將EC109細胞轉(zhuǎn)移至含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中后，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d進行一次傳代，隔天更換一次培養(yǎng)基以供給細胞營養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 使用MTT法檢測各個用藥組的細胞活力

將EC109細胞接種于96孔板中，孵育過夜。將不含藥物的培養(yǎng)基加入對照孔中，用PTX和Res單獨使用以及不同濃度的PTX和Res組合處理細胞48 h，然后每孔加入20 μlMTT。4 h后吸去96孔板中的溶液，每孔加入150 μLDMSO。搖床上震蕩10 min。使用酶標儀在490 nm處讀取每孔的吸光度。

1.4 結(jié)晶紫染色檢測細胞的克隆形成能力

將EC109細胞接種于6孔板中每孔鋪1 000個細胞。隔夜培養(yǎng)后，使用不同組別的藥物處理6孔板中的細胞48 h。棄去含藥物的培養(yǎng)基并加入全新培養(yǎng)基。然后將細胞培養(yǎng)7天，期間隔天換液。7天后棄去舊培養(yǎng)基，PBS洗2次，加1 mL甲醇固定30 min，棄去固定液，PBS洗2次，每孔加入2 mL 1%結(jié)晶紫染液，染色30 min。棄去染液，PBS洗3次。室溫自然晾干。Image J計數(shù)細胞集落。相機拍攝集落圖像。實驗獨立重復三次。

1.5 Hoechst 33258染色法檢測細胞核的變化情況

將細胞接種在提前放入無菌玻璃片的6孔板中，隔夜培養(yǎng)后，使用不同組別的藥物處理24 h。藥物處理后，棄去藥液，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗6孔板，Hoechst 33258避光染色30 min。PBS洗2次，充分洗去多余染料，小心取出玻璃片，蓋在蓋破片上，用濾紙吸走周邊殘余液體，熒光顯微鏡觀察拍照。實驗獨立重復三次。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

通過流式細胞儀用AnnexinV-FITC/PI染色試劑盒分析細胞凋亡。將EC109細胞接種在6孔板中貼壁，并用藥物處理細胞24 h。收集細胞，PBS洗2次，加入Binding Buffer，然后加入1 μL Annexin V-FITC染液，避光染色10 min，每組樣品加入PI染色液1 μL，避光染色5 min。加入適量PBS調(diào)節(jié)細胞濃，渦旋，處理完樣品后使用流式細胞儀檢測每組樣品中細胞凋亡百分比。實驗重復三次。

1.7 羅丹明123（Rh123）外排實驗檢測細胞內(nèi)Rh123蓄積情況

將EC109細胞接種于6孔板中，孵育過夜。藥物處理后繼續(xù)孵育24 h。隨后，加入用新鮮培養(yǎng)基配制的1 μg/mL Rh123溶液，在細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。收集細胞，PBS洗兩次。流式細胞儀分析細胞內(nèi)羅丹明熒光強度。

1.8 HPLC檢測細胞內(nèi)PTX含量

取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中。根據(jù)藥物的添加劑量分為四組：空白對照，PTX單用組（1，3 μg/mL PTX）、Res單用組（25 μM Res）、聯(lián)用組（1 μg/mL PTX+25 μM Res，3 μg/mL PTX+25 μM Res）。用不同組別的藥物處理細胞2 h，收集細胞，然后用PBS洗滌，離心并重懸在1 mL PBS中。用細胞破碎器破碎細胞。每管樣品加6 mL乙酸乙酯沉淀，渦旋5 min。4950 rpm，4℃，離心15 min。取上清5 mL，用氮氣吹掃儀吹干。將每個樣品重新溶解在100 μL甲醇溶液中，并在4℃下以11 500 rpm離心細胞15 min，然后通過HPLC進行檢測。隨后，用70 μL上清液用于定量分析。使用Agilent 1200 HPLC系統(tǒng)，分析樣品，所述系統(tǒng)包括四元泵，自動進樣器和UV檢測器。使用Kromasil C18色譜柱（150×4.6 mm，5 μm，Diamonsil）進行分離。流速為1.0 mL/min；流動相：甲醇∶乙腈∶水=35∶56∶39；檢測波長227 nm，柱溫30℃，進樣量20 μL。

1.9 統(tǒng)計方法

每項實驗重復三次。SPSS 21.0進行統(tǒng)計學分析，采用方差分析對數(shù)據(jù)進行比較。P＜0.05表示有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 Res降低PTX在EC109細胞中的細胞毒作用

為了測量Res和PTX單用和聯(lián)合用藥的細胞毒性，用不同濃度的PTX（10，30，60和120 nmol/L），Res（5，10和25 μmol/L）處理EC 109細胞48 h。結(jié)果如表1及圖1所示。PTX在濃度為10、30、60和120 nmol/L時可顯著抑制EC109細胞的增殖，且具有濃度依賴性。與單用PTX相比，三種不同濃度的Res對EC109細胞增殖均沒有明顯的抑制作用。然而，PTX在聯(lián)用Res時，Res顯著減弱了PTX對EC109細胞的細胞毒作用。通過CompuSyn軟件和Chou-Talalay方法對Res和PTX的聯(lián)用指數(shù)（CI）進行評估[12]，CI＜1表示協(xié)同作用，CI＞1表示拮抗作用，CI=1表示加和作用。實驗結(jié)果顯示，不同組合濃度中，Res聯(lián)用PTX的CI值均大于1，如圖2所示。根據(jù)實驗結(jié)果，我們選擇25 μM Res聯(lián)用60 nM PTX用于后期研究。

2.2 細胞形態(tài)學改變

為了觀察藥物處理引起的形態(tài)變化，在PTX濃度為60 nM，Res濃度為25 μM時，以不同組合對EC109細胞進行處理。結(jié)果如圖3所示?？瞻讓φ战M中EC109細胞粘附狀態(tài)及生長狀態(tài)良好，具有清晰的邊界和不規(guī)則形狀。用25 μMRes處理后，EC109細胞的細胞狀態(tài)和形狀與空白對照組相比沒有顯著變化。當用60 nM PTX處理時，細胞變圓，體積減小，細胞漂浮，大多數(shù)細胞經(jīng)歷了類似于細胞凋亡的形態(tài)學改變。當用PTX和Res同時處理細胞時，細胞形態(tài)又趨于正常，細胞數(shù)顯著增加，細胞碎片減少。

表1 PTX與Res聯(lián)用對EC109細胞細胞活力的影響（%）（n=3）Table 1 Effect of PTX combined with Res on EC109 cell viability（%）（n=3）

圖1 PTX與Res聯(lián)用對EC109細胞細胞活力的影響Figure 1 Effect of PTX combined with Res on EC109 cell viability

圖2 不同藥物處理組中的聯(lián)合用藥指數(shù)Figure 2 Combination index in different drug treatment groups

圖3 不同藥物處理組的細胞形態(tài)（200×）Figure 3 Cell morphology in different drug treatment groups（200×）

2.3 Res減少PTX誘導的細胞凋亡

以上結(jié)果表明，Res顯著削弱了PTX在EC109細胞中的細胞毒性?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示，PTX處理過的組別中，幾乎沒有觀察到細胞克隆所形成的集落，克隆形成率為（10.81±1.24%）。當用Res聯(lián)合PTX處理細胞時，EC109的克隆形成能力相較于單獨使用PTX處理時顯著增強，且克隆形成率增加至（18.81±2.91%），見表2。

表2 不同藥物處理組中的克隆形成率Table 2 Colony formation ratein different drug treatment groups

通過Hoechst 33258染色和流式細胞術(shù)來檢測EC109細胞的凋亡。Hoechst 33258染色用于觀察形態(tài)學變化，Annexin V和PI染色用于研究細胞凋亡率。不同藥物處理組的EC109細胞用Hoechst 33258染色并在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖4所示。在空白對照組中觀察到細胞核中的藍色熒光較為均勻。用60nM PTX處理后，觀察到細胞核碎裂和明顯的凋亡小體。在25 μM Res處理組中，只有少數(shù)細胞表現(xiàn)出核染色質(zhì)凝聚和凋亡小體。然而，在用60 nM PTX與25 μM Res聯(lián)用處理后，與單用PTX處理組相比，凋亡細胞的數(shù)量顯著降低。

圖4 不同藥物處理組中細胞凋亡相關(guān)的形態(tài)學變化（200×）Figure 4 Morphological changes related to apoptosis in different drug treatment groups（200×）

Annexin V/PI凋亡試劑盒用于檢測流式細胞儀檢測細胞凋亡百分比，如表3及圖5所示。在EC109細胞中，單用60 nM PTX組可引起細胞凋亡，凋亡率為（39.8±5.67%）。單用25 μM Res組中凋亡率為（14.1±2.53%）。然而與單用PTX對比，聯(lián)合Res用藥組的細胞凋亡率明顯下降，凋亡率為（22±3.99%）。這些結(jié)果表明，在一定濃度下，Res可拮抗PTX誘導的細胞凋亡作用。

2.4 Res與PTX聯(lián)用可增強P-gp活性

Rh123是一種黃綠色熒光染料，是P-gp跨膜蛋白的特異性底物，在低濃度下無細胞毒性[13]。若P-gp的轉(zhuǎn)運能力增強，Rh123的攝取將減少，細胞中的平均熒光強度將降低。使用FlowJo 7.6軟件分析數(shù)據(jù)。細胞內(nèi)積累的熒光強度顯示，與單用PTX相比，組合組中平均熒光強度降低2.02倍。P-gp可介導Rh123積累量的變化。結(jié)果表明，Res與PTX聯(lián)用時通過增強P-gp活性降低了EC109細胞中的PTX積累。實驗結(jié)果如表4所示。

2.5 Res減少細胞內(nèi)PTX的積累

通過HPLC檢測不同用藥組中細胞內(nèi)PTX的積累濃度。結(jié)果如表5和圖6所示。短箭頭標識的為PTX的吸收峰，保留時間為6.99 min。利用所用的色譜條件，可以分離細胞內(nèi)的PTX和內(nèi)源性物質(zhì)，沒有雜質(zhì)干擾。1 μg/mL和3 μg/mL PTX與25 μM Res聯(lián)用組均比PTX單用組細胞內(nèi)PTX的含量低。結(jié)果表明，Res減少了EC190細胞中PTX的積累。

表3 不同藥物處理組中的細胞凋亡率Table 3 Apoptosis rate in different drug treatment groups

3 討論

圖5 不同藥物處理組細胞凋亡結(jié)果Figure 5 Apoptosis results of different drug treatment groups

表4 不同藥物處理組的細胞平均熒光強度Table 4 Average fluorescence intensity of cells in different drug treatment groups

食管癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其治療方案較多，在很多情況下藥物聯(lián)用的治療方案是有效的，但也存在藥物之間的拮抗作用。值得注意的是，本研究結(jié)果顯示，PTX和Res之間的相互作用降低了PTX抑制食管癌的療效。通過HPLC實驗，我們發(fā)現(xiàn)Res可降低PTX在細胞內(nèi)的蓄積，但是Res拮抗PTX的更深入的作用機制有待進一步研究。

來自蔬菜和水果的天然化合物通常被認為是安全的，很多研究也表明其可降低患癌風險。因此，合理的膳食補充劑、中草藥可與處方藥物同時使用。Res作為惡性腫瘤患者膳食的佐劑，可能與藥物具有相互作用。此外，還要考慮來自食物中Res在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄特性，才能確定惡性腫瘤患者在使用PTX時能否能同時補充Res。然而，藥物與植物化學物質(zhì)之間相互作用的研究太少。食物成分對P-gp等藥物轉(zhuǎn)運蛋白功能的影響尚未得到廣泛研究[14]。有研究在膀胱癌、乳腺癌等惡性腫瘤中觀察到Res和PTX聯(lián)用會抑制PTX的抗腫瘤作用，且在乳腺癌的研究中，通過動物體內(nèi)實驗證實了Res聯(lián)用PTX會降低PTX誘導的細胞凋亡作用[15，16]?；谏鲜鲅芯?，食管癌患者在使用PTX治療期間，食用含有Res的食物似有降低PTX藥效的風險，然而這一理論在未來仍需體內(nèi)和臨床的進一步驗證。

表5 不同藥物處理組細胞內(nèi)PTX的積累濃度Table 5 Accumulated concentration of PTX in cells of different drug treatment groups

圖6 不同藥物處理組中PTX的吸收峰面積Figure 6 The area of PTX absorption peak in different drug treatment groups