李元一，邢可馨，張葆春，申春華，徐巖，唐柯*

1(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)4(煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司，山東 煙臺，264000)

白蘭地是葡萄經(jīng)過酒精發(fā)酵、蒸餾、橡木桶儲藏、調(diào)配而成的葡萄蒸餾酒，位于世界六大蒸餾酒之列。而香氣則是白蘭地質(zhì)量評價中最重要的標(biāo)準(zhǔn)之一，不同的香氣表現(xiàn)，反映了一款白蘭地的原料品種、風(fēng)土條件、釀造工藝等，其決定著白蘭地的風(fēng)格和典型性，所以探究產(chǎn)區(qū)白蘭地的香氣特征一直是白蘭地風(fēng)味研究領(lǐng)域的熱點之一。法國[1-3]、德國[4]等國家地區(qū)已經(jīng)對其白蘭地的香氣特征有了較為深入的研究與分析，而國內(nèi)對白蘭地香氣特征的研究近年來也逐漸開展，但是研究大都集中在檢測方法的優(yōu)化[5-6]和成分分析方面[7-8]，我國白蘭地區(qū)別于其他國家地區(qū)白蘭地的典型特征香氣尚未明晰。

目前，風(fēng)味研究主要包括儀器和感官分析2個方面。在香氣的儀器分析中，一維氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)是最常見的檢測分析方法，而隨著全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，相比于普通的一維氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)，其有著高峰容量、高靈敏度、檢測物質(zhì)多等優(yōu)點[9]。對于一些在一維色譜柱上通常會共流出的化合物，可以通過第二根柱子進(jìn)行再次分離，從而大大改善了峰掩映的問題，目前已廣泛應(yīng)用于酒類香氣的研究中。如WELKE等[10]用頂空固相微萃取結(jié)合全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(headspace solid-phase microextraction with comprehsive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectromtry，HS-SPME-GC×GC-TOFMS)鑒別了霞多麗葡萄酒中243種揮發(fā)性化合物，同時測定了揮發(fā)性化合物的氣味活度值和相對氣味貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)辛酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯和β-大馬酮與其他43種化合物對葡萄酒香氣具有較大的貢獻(xiàn)潛力；陳雙等[11]用HS-SPME-GC×GC-TOFMS在芝麻香型白酒中解析了340種揮發(fā)性化合物并首次鑒定11種硫化物和12種萜烯類化合物，對芝麻香型白酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)和生理功能的都具有重要意義；張小倩等[12]用HS-SPME-GC×GC-TOFMS比較了4種不同酵母發(fā)酵的冰葡萄酒中的揮發(fā)性化合物，共解析了156種香氣成分，發(fā)現(xiàn)不同的酵母對不同種類化合物的代謝具有明顯的差異。

感官評價方面，定量描述分析(quantitative descriptive analysis, QDA)是一種常見的分析方法，其使用一個經(jīng)過高度訓(xùn)練的評價小組來描述和量化某個產(chǎn)品或者某類產(chǎn)品的感官屬性，可以很好的表征產(chǎn)品的特征和屬性強度[13]。但是由于時間和人力成本的提高，越來越多的感官實驗趨向于簡單，快速，準(zhǔn)確的感官分析方法[14]。Napping?是一種根據(jù)產(chǎn)品相似性對其進(jìn)行擺放的快速感官分析方法，最早應(yīng)用于葡萄酒的感官實驗中[15]。相比較于QDA，Napping?節(jié)省了大量的時間和人力，可以快速獲得產(chǎn)品的特定感官屬性信息和關(guān)鍵特征的描述概況[16]。如OLIVER等[17]對草莓進(jìn)行感官測評，對比了Napping?與QDA之間的準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)Napping?結(jié)合Ultra Flash Profiling (UFP)，可以達(dá)到QDA的近似效果，2種感官分析方法得到的結(jié)果具有很好的一致性。

本研究以中國煙臺地區(qū)和法國干邑地區(qū)的白蘭地為研究對象，通過HS-SPME-GC×GC-TOFMS儀器分析和Napping?感官分析相結(jié)合，探究不同產(chǎn)區(qū)白蘭地的香氣特征。研究不僅可以豐富我國白蘭地的風(fēng)味化學(xué)理論體系，同時對于進(jìn)一步調(diào)控我國白蘭地的生產(chǎn)也提供重要的風(fēng)味導(dǎo)向依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

實驗選取了9款白蘭地作為樣品，均由煙臺張裕集團有限公司提供。具體信息如表1所示。

表1 白蘭地樣品信息Table 1 Brandy sample information

1.1.2 試劑

NaCl(分析純)，上海國藥集團；C7～C30直鏈正構(gòu)烷烴、4-甲基-2-戊醇(色譜純)，Sigma-Aldrich；超純水。

1.1.3 感官實驗材料

40 cm×60 cm的白紙，鉛筆，橡皮，上海晨光文具股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

純水儀，美國Millipore公司；Agilent 7890B 氣相色譜，一維色譜柱DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美國Agilent公司；KT-2001冷噴調(diào)制器，美國Zoex公司；Pegasus?4D 飛行時間質(zhì)譜儀，美國Leco公司；DVB/CAR/PDMS三相萃取頭(2 cm 50/30 μm)，美國Supelco公司；MPS2多功能自動進(jìn)樣系統(tǒng)，德國Gerstel公司；二維色譜柱Rxi-17Sil MS(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Restek公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析

1.3.1.1 頂空固相微萃取(HS-SPME)方法

取0.5 mL白蘭地樣品，4.5 mL超純水置于20 mL頂空樣品瓶中，加入1.5 g NaCl，10 μL 4-甲基-2-戊醇(質(zhì)量濃度為103.4 mg/L)作為內(nèi)標(biāo)[3]，由MPS2系統(tǒng)進(jìn)行HS-SPME自動進(jìn)樣。參考實驗室之前建立的方法并加以改進(jìn)，萃取溫度50 ℃，樣品平衡5 min，萃取45 min，轉(zhuǎn)速為400 r/min。萃取結(jié)束后，將萃取頭置于GC進(jìn)樣口，在250 ℃下解析附5 min，不分流進(jìn)樣，每個樣品重復(fù)3次。

1.3.1.2 全二維飛行時間質(zhì)譜(GC×GC-TOFMS)方法

參考實驗室之前建立的方法并做優(yōu)化[18]。GC×GC條件：起始溫度45 ℃保持3 min后，以4 ℃/min升溫至150 ℃并保持2 min;以6 ℃/min升溫至200 ℃，然后以10 ℃/min升溫至230 ℃并保持10 min。第2個烘箱的溫度全程保持比一維烘箱高5 ℃。調(diào)制補償溫度為20 ℃，調(diào)制周期為4 s(熱脈沖時間 0.8 s)。樣品運行采用恒流模式，載氣為高純He(純度>99.999 5%)，流速為1 mL/min。

TOFMS條件：離子源電壓為70 eV，溫度為230 ℃，傳輸線溫度為240 ℃，檢測器電壓為1 430 V，采集質(zhì)量數(shù)為35～400 amu，采集頻率為100 spectra/s。

1.3.2 感官分析

1.3.2.1 感官小組的建立與培訓(xùn)

實驗采用自愿報名的方式進(jìn)行品評員的招募，通過填寫問卷的形式，對符合標(biāo)準(zhǔn)(無吸煙史，無過敏史，身體健康，有空余時間)的67人進(jìn)行基本嗅覺及味覺等感官靈敏度測試，篩選出24人。對選出的24人進(jìn)行為期1個月(每周1次)的基本感官培訓(xùn)，通過香氣識別檢驗、差別檢驗、分類標(biāo)尺使用檢驗，復(fù)篩出15人組成感官小組。對感官小組的15名品評員進(jìn)行為期3個月(每周1次)定期針對性培訓(xùn)，最終通過香氣辨別能力及描述測試，進(jìn)行后續(xù)試驗。實驗前要讓品評員熟悉樣品，并了解Napping?及UFP的實驗方法。

1.3.2.2 Napping?

將9個白蘭地樣品放入品評杯中并標(biāo)注3位隨機編碼，一次性提供給感官小組品評員。品評員要根據(jù)酒樣香氣特征的相似性及差異性，將樣品放置在40 cm×60 cm的白紙上進(jìn)行擺放。樣品間的擺放距離越近，表明樣品的相似度越高；樣品間的擺放距離越遠(yuǎn)，表明樣品間的差異性越大。當(dāng)全部酒樣擺放完成后，再將樣品的對應(yīng)位置標(biāo)記圓點，并標(biāo)注樣品編號。以白紙的長和寬作為橫軸和縱軸，統(tǒng)計樣品位置的坐標(biāo)信息。

1.3.2.3 Ultra Flash Profiling (UFP)

在品評員完成Napping?后，要求其在每個樣品的對應(yīng)位置旁邊寫出3～5個具有特征性和典型性的香氣描述詞。對每個樣品香氣特征描述詞進(jìn)行歸類并統(tǒng)計出現(xiàn)頻次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 GC×GC-TOFMS數(shù)據(jù)處理

白蘭地中揮發(fā)性化合物的定性：用LECO公司軟件ChromaTOF處理試驗采集的數(shù)據(jù)。自動識別信噪比(S/N)>200的色譜峰，然后進(jìn)行自動解卷積和質(zhì)譜庫(NIST 2014和Wiley 9)比對。運用軟件的數(shù)據(jù)比較功能(statistical comparison)自動匹配相似度(similarity)≥800且3個平行樣品中至少出現(xiàn)2次的峰作為該酒樣中存在的組分。系統(tǒng)通過同條件下進(jìn)樣的正構(gòu)烷烴(C7～C30)和樣品中化合物的出峰時間，自動計算每個化合物的保留指數(shù)(retention index，RI)，經(jīng)過文獻(xiàn)比對，篩選RI相差30的化合物作為最終的定性結(jié)果。

白蘭地中揮發(fā)性化合物的半定量計算如公式(1)所示：

(1)

式中：化合物和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度的單位為μg/L。

1.4.2 感官實驗數(shù)據(jù)處理

采用 R 語言 3.4.3 進(jìn)行普氏多維向量分析(procrustes multiple factor analysis，PMFA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC×GC-TOFMS分析

2.1.1 白蘭地?fù)]發(fā)性化合物組分分析

通過HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析，在中國和法國白蘭地中共鑒別出512種揮發(fā)性化合物(表2)。其中酯類化合物占21.88%，是鑒別出來的數(shù)量最多的一類化合物，也與之前的研究結(jié)果相一致[6]。其次是醇類、芳香族和羰基類化合物，分別占15.04%、16.80%、16.21%。

表2 中法白蘭地HS-SPME-GC×GC-TOFMS中鑒定的揮發(fā)性化合物Table 2 Volatile compounds identified in Chinses and French brandies by HS-SPME-GC×GC-TOFMS

醇類是白蘭地中一類很重要的香氣化合物，主要生成于白蘭地的第1次蒸餾過程[2]，表現(xiàn)為果香和花香，可以給酒帶來積極的香氣特征。而含硫化合物的種類較少，這是由白蘭地特殊的生產(chǎn)工藝決定的。其在發(fā)酵前不能添加SO2，并且在大多數(shù)的白蘭地生產(chǎn)時采用銅制的壺式蒸餾器，銅離子可以與硫化物發(fā)生反應(yīng)，因此2次蒸餾后，酒中硫化物會大大減少[19]。

2.1.2 白蘭地?fù)]發(fā)性香氣組分分析

在所有樣品中定性出的揮發(fā)性化合物中，并非都具有香氣特征，風(fēng)味的研究則更關(guān)注具有香氣特征的化合物。因此對于已經(jīng)定性的數(shù)據(jù)，又通過Flavornet Home(http://www.flavornet.org/index.html)和Flavor DB(https://cosylab.iiitd.edu.in/flavordb/)2個香氣數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，最終鎖定157種具有香氣特征地?fù)]發(fā)性化合物進(jìn)行半定量計算，進(jìn)一步采用單因素方差分析，篩選42種具有顯著差異(P≤0.05)的香氣化合物，制作熱圖(圖1)。熱圖分析結(jié)果可以看出，中國煙臺的白蘭地較好的聚為一類，法國干邑的白蘭地聚為一類，并且法國干邑地區(qū)3款VSOP單獨聚為一類，3款XO單獨聚為一類，中法白蘭地根據(jù)化合物的種類和含量具有較為明顯的產(chǎn)地及等級特征性。

此外，熱圖可以將化合物的含量通過顏色的變化直觀展現(xiàn)出來。由圖1可知，組分A是中國張裕白蘭地中質(zhì)量濃度含量較高的化合物，主要是酯類和萜烯類化合物。酯類物質(zhì)主要表現(xiàn)為水果香、花香，如庚酸乙酯，丙酸乙酯，壬酸甲酯等。萜烯類化合物主要來源于葡萄果實[20]，橙花醇表現(xiàn)為花香，黃樟醚表現(xiàn)為甜香，而松油醇，β-松油醇則表現(xiàn)為松柏，肉豆蔻的香氣。組分B是法國6款白蘭地中質(zhì)量濃度較高的化合物。其中庚酸以蘑菇和生青味為香氣特征，MALFONDET等[21]也曾解析出該化合物為法國白蘭地中比較重要的香氣成分。組分C是張裕XO級別白蘭地中濃度含量較高的化合物。其中丁子香酚是橡木桶陳釀的典型產(chǎn)物之一，具有丁香和香料的特征香氣，隨著陳釀時間的增加，丁子香酚在酒樣中的含量也逐漸增加[22]。丁子香酚在相同品牌下XO級別的白蘭地比VSOP級別的白蘭地含量明顯要高，這一結(jié)果也與前人研究的結(jié)果相一致[22]。

圖1 中法白蘭地的顯著性差異香氣組分熱圖分析和HCA聚類分析Fig.1 Heat map and hierarchical clustering analysis(HCA) of aroma compounds with a significant difference in Chinese and French brandies

2.2 感官分析

Napping?作為最早應(yīng)用于葡萄酒中的快速感官分析方法，也被應(yīng)用于白蘭地的感官之中。LOUW等[25]采用Napping?，對白蘭地視覺、前鼻香和口腔感覺(包括基本味覺、口感和后鼻嗅)這3種特征進(jìn)行評估和測試，發(fā)現(xiàn)顏色和后鼻嗅的感知與否對小組成員在味覺和口感中的評估并無影響，同時成功地捕捉白蘭地之間的口感差異，也為后面白蘭地的Napping?感官研究提供了更多的科學(xué)依據(jù)。

為深入探究中法白蘭地的香氣特征的差異，本文采用快速感官分析方法Napping?進(jìn)行實驗。在感官數(shù)據(jù)收集整理后，采用R語言的PMFA算法，對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，分別生成評價小組對產(chǎn)品的聚類特征圖和香氣特征相關(guān)性圖。由圖2可知，中國與法國白蘭地明顯分為2類，中國煙臺的3款白蘭地單獨聚為一類，主要集中在第4象限；法國干邑的白蘭地則聚為一類。其中香料、焦糖、干果、奶油為中國煙臺白蘭地區(qū)別于法國干邑白蘭地的主要香氣特征。

a-香氣特征相關(guān)性圖；b-聚類特征圖圖2 中法白蘭地Napping?結(jié)合 UFP 的普氏向量分析Fig.2 Procrustes multiple factor analysis of Napping? with UFP between French and Chinese brandies

3 結(jié)論

采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS解析中國煙臺地區(qū)和法國干邑地區(qū)的9種白蘭地，共鑒定出512種揮發(fā)性化合物，其中酯類化合物種類最多。通過香氣數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步篩選后經(jīng)過熱圖分析，結(jié)果表明根據(jù)香氣組分種類和含量差異，可以明顯區(qū)分中國和法國的白蘭地。Napping?結(jié)合UFP感官分析結(jié)果可以看出，香料、焦糖、干果、奶油是中國煙臺白蘭地區(qū)別于法國干邑地區(qū)的主要香氣特征。本研究豐富了我國白蘭地的風(fēng)味化學(xué)理論體系，也為進(jìn)一步開展我國白蘭地的風(fēng)味研究提供借鑒依據(jù)。