孫培利，車正清，焦捷，蒲瑩，王樹林,2,3*，杜艷

1(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧， 810016)2(青海-甘肅食品研發(fā)與檢測聯(lián)合實驗室，青海 西寧， 810016)3(青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，青海 西寧， 810016)4(青海省青稞資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，青海 西寧， 810016)

青稞(HordeumvulgareLinn.)屬于禾本科大麥屬農(nóng)作物，主要分布在西藏、青海、四川等高原地區(qū)，是青藏高原地區(qū)的主糧品種[1]。有關(guān)青稞的研究主要集中在青稞多肽、β-葡聚糖[2]等功能性成分提取，發(fā)酵青稞酒[3]，青稞育種[4]等方面。青稞具有“高蛋白、高纖維素、高維生素、低脂肪、低糖”的營養(yǎng)特點，符合當(dāng)下人們健康的飲食結(jié)構(gòu)[5]。淀粉是青稞主要成分，含量在64%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))左右，其中支鏈淀粉含量占70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))以上[6]。目前，有關(guān)谷物淀粉的報道多集中在淀粉含量、結(jié)構(gòu)及直/支鏈淀粉比例對淀粉溶解度、膨脹力、糊化特性及加工特性的影響[7-9]，而通過發(fā)酵技術(shù)改善谷物淀粉品質(zhì)的研究較少，主要是通過發(fā)酵技術(shù)來提高谷物類產(chǎn)品的營養(yǎng)品質(zhì)和感官特性[10-11]。PRANOTO等[12]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵的高粱粉，體外淀粉消化率、峰值黏度和熱糊黏度增加，糊化溫度降低。因此通過發(fā)酵改善青稞淀粉品質(zhì)，有望進(jìn)一步提高青稞營養(yǎng)品質(zhì)及口感。

嗜酸乳桿菌作為益生菌，產(chǎn)酸能力強，耐酸性高，能產(chǎn)生細(xì)菌素、乳酸及過氧化氫等物質(zhì)，抑制胃腸道中有害微生物的生長，且具有多種藥理功能[13]。目前嗜酸乳桿菌多用于奶制品、果汁、酵素產(chǎn)品的發(fā)酵[14]及微膠囊制備等[15]，由嗜酸乳桿菌發(fā)酵的產(chǎn)品不僅口感好，且營養(yǎng)價值相對較高，應(yīng)用前景相當(dāng)廣闊。有關(guān)嗜酸乳桿菌在青稞發(fā)酵中的研究較少，由于在發(fā)酵過程中其自身代謝產(chǎn)酶能力不足，不能直接利用谷物中大分子營養(yǎng)物質(zhì)，單獨發(fā)酵效果不佳[10]。因此，本試驗以脫皮青稞粉為原料，通過酵母及嗜酸乳桿菌復(fù)合發(fā)酵達(dá)到改善青稞淀粉理化特性的目的，為青稞類產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫皮青稞，青海新丁香糧油有限公司；嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，BNCC138598)，北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，安琪酵母股份有限公司；直鏈淀粉含量試劑盒、支鏈淀粉含量試劑盒，南京建成生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1780紫外可見分光光度計，島津企業(yè)管理有限公司；NDJ-1B旋轉(zhuǎn)黏度儀，上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司；HJ-4A數(shù)顯恒溫多頭磁力攪拌器，常州崢嶸儀器有限公司。

1.3 實驗方法與設(shè)計

1.3.1 菌種活化

菌種活化參照張杰等[16]的方法。

1.3.2 青稞粉發(fā)酵工藝

青稞粉發(fā)酵工藝流程如下：

脫皮青稞→粉碎滅菌→加無菌水→酵母發(fā)酵→乳酸發(fā)酵→發(fā)酵青稞粉→淀粉提取

將脫皮青稞于粉碎機中打碎后過100目篩，分裝于錐形瓶中，在121 ℃滅菌15 min，滅菌后的青稞粉以1∶15(g∶mL)的料液比加入無菌水；接種體積分?jǐn)?shù)3%的活化后釀酒酵母，于28 ℃下恒溫發(fā)酵2 h；酵母發(fā)酵后，接種體積分?jǐn)?shù)5%的活化嗜酸乳桿菌，于37 ℃下恒溫發(fā)酵1.5 d；利用堿提醇洗法提取淀粉。

1.3.3 單因素試驗

在接種釀酒酵母發(fā)酵的基礎(chǔ)上以直鏈淀粉含量、支鏈淀粉含量、淀粉溶解特性及糊化特性為指標(biāo)，分別考察嗜酸乳桿菌發(fā)酵時間(1、1.5、2、2.5、3 d)、發(fā)酵溫度(27、32、37、42、47 ℃)和接種量(1%、2%、3%、4%、5%)對青稞淀粉品質(zhì)的影響。

1.3.4 正交試驗

為得到發(fā)酵最佳工藝參數(shù)，在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和接種量為因素，設(shè)計L9(34)正交表，以直鏈淀粉含量和峰值黏度為指標(biāo)確定最佳發(fā)酵工藝條件。因素水平表如表1所示。

表1 復(fù)合菌種發(fā)酵青稞粉正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermenting highland barley flour by compound strains

1.3.5 青稞淀粉的提取

參照張慧娟等[17]方法提取發(fā)酵前后青稞淀粉。

1.4 主要指標(biāo)測定方法

直、支鏈淀粉含量的測定：發(fā)酵前后青稞直、支鏈淀粉含量采用試劑盒法測定。

淀粉糊化特性的測定：參照ZHANG等[18]方法測定。

淀粉溶解特性的測定：參照王佩佩[19]的方法測定。計算如公式(1)、公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：S，溶解度，%；B，膨脹力，%；A，烘干后上清液質(zhì)量，g；W，淀粉干重，g；P，離心后沉淀質(zhì)量，g。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。試驗結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時間對青稞淀粉品質(zhì)影響

發(fā)酵時間對青稞直、支鏈淀粉含量的影響如圖1所示。隨發(fā)酵時間的延長，青稞直鏈淀粉含量呈波動變化趨勢，發(fā)酵2 d時，青稞直鏈淀粉含量最低為 8.47%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；支鏈淀粉含量在發(fā)酵過程中變化較小，在發(fā)酵2 d時支鏈淀粉含量最高為44.77%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。原因可能是，隨發(fā)酵時間延長，乳酸菌產(chǎn)生的酸性物質(zhì)積累，抑制微生物自身生長，且酸性條件下代謝酶類影響支鏈淀粉結(jié)構(gòu)，使部分支鏈淀粉降解形成直鏈淀粉[20]。

A-直鏈淀粉；B-支鏈淀粉圖1 發(fā)酵時間對青稞淀粉含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on content of highland barley starch

發(fā)酵時間對青稞淀粉糊化性質(zhì)的影響如圖2所示。由圖2-A可知，發(fā)酵使青稞淀粉起始糊化溫度降低，發(fā)酵1 d時，起始糊化溫度最低為39.33 ℃。由圖2-B可知，發(fā)酵使青稞淀粉的回生值增大，峰值黏度降低，對崩解值影響較小，在發(fā)酵2 d后峰值黏度和崩解值基本穩(wěn)定。發(fā)酵過程中微生物作用使淀粉的無定形區(qū)結(jié)構(gòu)破壞，增強與水的結(jié)合能力，從而使起始糊化溫度和峰值黏度降低[21]。發(fā)酵初期，酵母菌首先利用青稞提供的營養(yǎng)物質(zhì)，使青稞中淀粉含量及結(jié)構(gòu)受到影響。發(fā)酵后期，嗜酸乳桿菌較強的產(chǎn)酸能力使微生物在酸性環(huán)境中逐漸進(jìn)入衰亡期，淀粉糊化特性處于穩(wěn)定狀態(tài)[22]。這與寇芳等研究結(jié)果相似[23]。

A-起始糊化溫度；B-黏度圖2 發(fā)酵時間對青稞淀粉糊化性質(zhì)的影響Fig.2 Effect of fermentation time on gelatinization characteristics of highland barley starch

發(fā)酵時間對青稞淀粉溶解特性的影響如圖3所示。由圖3-A可知，隨發(fā)酵時間延長，青稞淀粉的膨脹力增加，且發(fā)酵2 d的青稞淀粉在低于90 ℃時膨脹力均高于未發(fā)酵的青稞淀粉。由圖3-B可知，發(fā)酵后青稞淀粉的溶解度明顯增大，發(fā)酵時間低于1.5 d青稞淀粉溶解度在70 ℃以下時較高，發(fā)酵時間為2 d時，青稞淀粉溶解度在80 ℃下較高。原因是酵母菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶類使青稞粉中的大分子蛋白和脂肪水解，促進(jìn)淀粉溶出，使淀粉更易與水結(jié)合，使膨脹力和溶解度增大[20]。研究發(fā)現(xiàn)直鏈淀粉和支鏈淀粉含量同樣也會影響淀粉的膨脹力和溶解度[24]，該現(xiàn)象符合前面的研究結(jié)果。

A-膨脹力；B-溶解度圖3 發(fā)酵時間對青稞淀粉溶解特性的影響Fig.3 Effect of fermentation time on dissolution characteristics of highland barley starch

分析發(fā)酵時間對青稞淀粉品質(zhì)的影響可知，發(fā)酵時間應(yīng)控制在2 d。

2.1.2 發(fā)酵溫度對青稞淀粉品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度對青稞直、支鏈淀粉含量的影響如圖4所示。青稞直鏈淀粉和支鏈淀粉含量整體上隨溫度的升高呈先升高后降低的趨勢，直鏈淀粉含量在42 ℃時達(dá)到最大值10.99%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，支鏈淀粉含量在32 ℃時達(dá)到最大值50.79%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。由于溫度在升高的過程中逐漸達(dá)到微生物生長和代謝酶類的最適溫度，使酶類活動增強，影響青稞中直支鏈淀粉含量。

A-直鏈淀粉；B-支鏈淀粉圖4 發(fā)酵溫度對青稞淀粉含量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on content of highland barley starch

發(fā)酵溫度對青稞淀粉糊化性質(zhì)的影響如圖5所示。由圖5-A可知，當(dāng)發(fā)酵溫度高于37 ℃時，青稞淀粉起始糊化溫度趨于穩(wěn)定。由圖5-B可知，溫度對發(fā)酵青稞淀粉的回生值影響最大，其次是峰值黏度，對崩解值影響較小。青稞淀粉的回生值在32 ℃達(dá)到最高為1 761.67 mPa·s，峰值黏度和崩解值最低，分別為910.00和98.33 mPa·s。發(fā)酵溫度的升高，使支鏈淀粉鏈長和聚合度降低，減小淀粉之間空間位阻，使淀粉的起始糊化溫度和峰值黏度降低，同時發(fā)酵作用使淀粉降解為小分子的過程中有序結(jié)構(gòu)被破壞，因此回生值增加[25]。

發(fā)酵溫度對青稞淀粉溶解性質(zhì)的影響如圖6所示。由圖6-A可知，當(dāng)發(fā)酵溫度低于37 ℃時，青稞淀粉膨脹力在低于90 ℃時相對較高。由圖6-B可知，發(fā)酵后青稞淀粉溶解度顯著升高，在27 ℃的發(fā)酵條件下，青稞淀粉在60 ℃時溶解度最高，而發(fā)酵溫度高于42 ℃時溶解度降低?？梢?，當(dāng)發(fā)酵溫度超過42 ℃時，青稞淀粉的溶解特性較差。

A-起始糊化溫度；B-黏度圖5 發(fā)酵溫度對青稞淀粉糊化性質(zhì)的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on gelatinization characteristics of highland barley starch

A-膨脹力；B-溶解度圖6 發(fā)酵溫度對青稞淀粉溶解特性的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on dissolution characteristics of highland barley starch

分析發(fā)酵溫度對青稞淀粉品質(zhì)的影響可得，當(dāng)發(fā)酵溫度過高時，青稞淀粉的品質(zhì)下降，因此發(fā)酵溫度應(yīng)控制在32 ℃。

2.1.3 接種量對青稞淀粉品質(zhì)的影響

接種量對青稞直、支鏈淀粉含量的影響如圖7所示。隨著接種量的增加，直鏈淀粉的含量呈先降低后升高趨勢，接種量為3%時達(dá)最低值7.79%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，支鏈淀粉的含量整體呈平緩下降趨勢。隨著接種量增加，微生物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)需求更高，因此直鏈淀粉被大量降解。SASAKI等[26]研究發(fā)現(xiàn)鏈長較短的支鏈淀粉更易被酶解，因此當(dāng)嗜酸乳桿菌接種量增加時，部分支鏈淀粉降解并重排形成直鏈淀粉，使后期直鏈淀粉含量升高。

A-直鏈淀粉；B-支鏈淀粉圖7 接種量對青稞淀粉含量的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on content of highland barley starch

接種量對青稞淀粉糊化性質(zhì)的影響如圖8所示。由圖8-A可知，當(dāng)菌種的接種量超過3%時，青稞淀粉的起始糊化溫度保持恒定。由圖8-B可知，隨著接種量的增加，青稞淀粉峰值黏度呈緩慢下降后上升的趨勢，當(dāng)接種量為4%時，峰值黏度最低為946.67 mPa·s；崩解值隨接種量的增加呈波動變化，當(dāng)接種量超過2%時，崩解值相對穩(wěn)定；青稞淀粉的回生值變化較小。這可能是由于當(dāng)接種量超過3%時，發(fā)酵底物中的營養(yǎng)物質(zhì)有限，不利于微生物的生長，因此對結(jié)果無較大影響。

A-起始糊化溫度；B-黏度圖8 接種量對糊化性質(zhì)的影響Fig.8 Effect of inoculation amount on gelatinization characteristics of highland barley starch

接種量對青稞淀粉溶解特性的影響如圖9所示。由圖9-A可知，當(dāng)接種量超過3%時，青稞淀粉膨脹力均有不同程度的下降。由圖9-B可知，當(dāng)接種量為3%時，青稞淀粉在60～80 ℃溶解度較大，同樣當(dāng)接種量超過3%時，青稞淀粉的溶解度有不同程度的下降。研究表明直鏈淀粉的含量與淀粉膨脹力和溶解度呈負(fù)相關(guān)，溶解度和膨脹力之間呈正相關(guān)[27]，這與之前的研究結(jié)果一致。

A-膨脹力；B-溶解度圖9 接種量對青稞淀粉溶解特性的影響Fig.9 Effect of inoculation amount on dissolution characteristics of highland barley starch

由接種量對青稞淀粉品質(zhì)的影響可知，持續(xù)增加菌種接種量并不能更好地改善青稞淀粉的品質(zhì)，接種量應(yīng)控制在3%時比較合適。

2.2 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果如表2所示。由直鏈淀粉含量極差分析可知，發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和接種量對青稞直鏈淀粉含量的影響大小為rA>rC>rB，最優(yōu)組合為A1B3C3，即發(fā)酵時間1.5 d，發(fā)酵溫度37 ℃，嗜酸乳桿菌接種量5%；各因素對青稞峰值黏度的影響大小為RA>RB>RC，最優(yōu)組合為A1B1B1，可見對青稞峰值黏度及直鏈淀粉含量影響最大的因素均是發(fā)酵時間，而發(fā)酵溫度及接種量對2個指標(biāo)的影響大小不同，且最優(yōu)組合不同。研究表明，直鏈淀粉對谷物類產(chǎn)品的口感、質(zhì)地等有較大的影響，且當(dāng)直鏈淀粉含量較高時，峰值黏度相對較低，因此綜合試驗結(jié)果分析選擇直鏈淀粉含量較高的組合作為最優(yōu)發(fā)酵工藝，即發(fā)酵時間1.5 d，發(fā)酵溫度37 ℃，嗜酸乳桿菌接種量5%，此時直鏈淀粉的含量最高，為10.21%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，淀粉的峰值黏度相對較低，為1 063.67 mPa·s。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

3 結(jié)論

本試驗探討了乳酸菌發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度及接種量對青稞直鏈和支鏈淀粉含量、糊化特性和溶解特性的影響。青稞粉通過發(fā)酵后，直鏈淀粉含量升高，支鏈淀粉含量下降，起始糊化溫度和峰值黏度降低，回生值升高，對崩解值影響較小，膨脹力和溶解度均升高。通過正交優(yōu)化試驗，得出最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間1.5 d、發(fā)酵溫度37 ℃、嗜酸乳桿菌接種量5%，此時青稞直鏈淀粉含量為10.21%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，淀粉的峰值黏度相對較低，為1 063.67 mPa·s。試驗過程中，在發(fā)酵前期接種釀酒酵母，使其首先利用青稞中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長繁殖，為嗜酸乳桿菌的生長提供厭氧條件的同時產(chǎn)生相關(guān)的代謝酶類，降解青稞蛋白質(zhì)和脂肪，暴露出淀粉分子，使青稞淀粉更易降解，利于青稞淀粉品質(zhì)的改善。嗜酸乳桿菌將產(chǎn)生的低分子糖類轉(zhuǎn)化為酸類物質(zhì)，降低了發(fā)酵青稞粉的pH值，抑制基質(zhì)中其他微生物生長的同時影響青稞淀粉的相關(guān)品質(zhì)特性。發(fā)酵時間、溫度和接種量在一定范圍內(nèi)均能夠改善青稞淀粉品質(zhì)，該試驗結(jié)果對青稞類產(chǎn)品的深加工具有一定的參考價值。