齊慧林，楊方，余達(dá)威，劉曉麗，姜啟興，許艷順，于沛沛，夏文水

(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、食品學(xué)院，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無(wú)錫，214122)

鳀魚(yú)(Engraulisjapanicus)是一種小型中上層低值魚(yú)類(lèi)，平均體長(zhǎng)約8～12 cm，在我國(guó)的東海區(qū)、黃海區(qū)資源豐富。鳀魚(yú)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，但其個(gè)體小，容易腐爛，不適合鮮食，捕撈后常制成魚(yú)干，后加工成調(diào)味魚(yú)制品[1]。殺菌工藝對(duì)調(diào)味魚(yú)制品是必要的，可以保證產(chǎn)品的安全性并使其具有一定的貨架期，但高溫條件下發(fā)生的褐變反應(yīng)，影響調(diào)味魚(yú)的感官品質(zhì)。

美拉德反應(yīng)是食品加工過(guò)程中廣泛存在的一種非酶褐變反應(yīng)，是游離氨基酸，肽或蛋白質(zhì)的氨基與還原糖的羰基之間的復(fù)雜反應(yīng)，最終生成黑色素[2]。調(diào)味魚(yú)制品由于含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸和糖類(lèi)，高溫殺菌過(guò)程中容易發(fā)生美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致魚(yú)肉制品顏色加深。添加褐變抑制劑是食品工業(yè)中抑制褐變最廣泛采用的方法，可以通過(guò)添加活性氨基物質(zhì)、有機(jī)酸、抗氧化劑等對(duì)食品中的美拉德反應(yīng)進(jìn)行控制，減緩反應(yīng)帶來(lái)的不必要的顏色變化[3]。半胱氨酸是含有巰基的氨基酸，可以抑制食品中的多種褐變反應(yīng)，在罐頭、飲料以及鮮切果蔬類(lèi)食品中均有應(yīng)用[4]。檸檬酸是食品工業(yè)中常用的酸化劑和螯合劑，減緩飲料及罐頭類(lèi)食品中的美拉德等褐變反應(yīng)[5]。D-異抗壞血酸鈉是穩(wěn)定性較高的天然抗氧化劑，常用作休閑肉制品的護(hù)色劑[6]。王進(jìn)勉[7]的研究表明檸檬酸可以抑制魷魚(yú)絲浸提液的褐變反應(yīng)。黃梅桂[8]的研究表明半胱氨酸可以顯著抑制大豆肽美拉德反應(yīng)體系的顏色，適量的VC對(duì)美拉德褐變也有一定的抑制作用。

因此，本實(shí)驗(yàn)以調(diào)味鳀魚(yú)為研究對(duì)象，通過(guò)添加L-半胱氨酸、檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉3種護(hù)色劑對(duì)殺菌過(guò)程中的顏色變化進(jìn)行控制。利用A420、A294、熒光強(qiáng)度表征美拉德反應(yīng)程度，結(jié)合pH、還原糖、5-HMF指標(biāo)的分析，以期闡明護(hù)色劑對(duì)殺菌后改善調(diào)味魚(yú)顏色的原因，為調(diào)味水產(chǎn)食品的褐變控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳀魚(yú)干原料購(gòu)于無(wú)錫天蓬食品城，質(zhì)量(2.0±0.5) g，體長(zhǎng)(5.0±1.0) cm，水分含量44%；

三氯乙酸、無(wú)水乙醇、草酸、2-硫代巴比妥酸、葡萄糖、5-HMF均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

L-半胱氨酸、檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉均為食品級(jí)，浙江一諾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LE438 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；UltraScan Pro1166高精度分光測(cè)色儀，美國(guó)Hunterlab公司； UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；Waters 1525EF 高效液相色譜儀-示差折光檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；F-7000熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)GB 2760—2014，L-半胱氨酸、檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉可在各類(lèi)食品中按需添加。參考王進(jìn)勉[7]、黃梅桂[8]的研究結(jié)果，確定護(hù)色劑的添加量均為0.1%～0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。添加護(hù)色劑到拌料魚(yú)中，用高聚合尼龍復(fù)合聚乙烯袋真空封口，110 ℃，35 min殺菌后取樣，-20 ℃冰箱保存。對(duì)樣品的色差、pH、還原糖和5-HMF含量、熒光強(qiáng)度、A294、A420的變化進(jìn)行測(cè)定分析。

1.3.2 色差分析

采用高精度分光測(cè)色儀對(duì)調(diào)味魚(yú)表面的亮度(L*)、紅度(a*)、黃度(b*)值進(jìn)行測(cè)定。再根據(jù)公式(1)計(jì)算總色差ΔE[9]：

(1)

式中：L*，亮度；a*，紅度；b*，黃度。

1.3.3 pH值的測(cè)定

參照GB 5009.237—2016。

1.3.4 還原糖的測(cè)定

參照GENG等[10]的方法并加以改進(jìn)。將2.5 g攪碎的樣品用10 mL無(wú)水乙醇均質(zhì)，然后在4 ℃，1 000×g下離心5 min。用5 mL 80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇水溶液重復(fù)萃取3次，合并上清液并用雙層濾紙過(guò)濾。

提取液通過(guò)0.45 μm濾膜，通過(guò)HPLC分析。使用條件為：色譜柱：Waters Sugar-pak1 6.5 mm×300 mm；柱溫：40 ℃；檢測(cè)：示差折光檢測(cè)器；進(jìn)樣體積：15 μL；流動(dòng)相：0.1 mol/L NaNO3；流速：0.3 mL/min。

1.3.5 5-HMF的測(cè)定

參照LAMBERTS等[11]的方法并加以改進(jìn)。將2 g攪碎的樣品用9 mL 0.15 mol/L的草酸溶液均質(zhì)，振蕩提取30 min，與6 mL 40%(體積分?jǐn)?shù))三氯乙酸溶液混合，靜置10 min。在4 ℃，4 000×g下離心15 min，取4 mL上清液與1 mL 0.05 mol/L 2-硫代巴比妥酸溶液混合，40 ℃水浴30 min，冷卻后測(cè)定443 nm處吸光值。

1.3.6 吸光值的測(cè)定

參照GENG等[12]的方法并加以改進(jìn)。將3 g攪碎的樣品用10 mL預(yù)冷的去離子水均質(zhì)，然后與10 mL冷的20%三氯乙酸溶液勻漿混合。將混合物在 4 ℃，10 000×g下離心10 min，提取液用濾紙過(guò)濾后測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)370 nm；發(fā)射波長(zhǎng)440 nm)及在294 nm、420 nm處吸光值。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

色差測(cè)定重復(fù)5次，其余實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s多重分析進(jìn)行組間顯著性檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著。并用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 護(hù)色劑對(duì)調(diào)味魚(yú)顏色變化的影響

由表1可知，殺菌后，調(diào)味魚(yú)的L*、a*、b*、ΔE值分別下降了12.4%、26.3%、28.6%、17.7%，整體顏色變暗，這與TANG等[13]的研究結(jié)果一致。魚(yú)罐頭中含有的糖類(lèi)和蛋白質(zhì)在殺菌過(guò)程中因受熱發(fā)生美拉德反應(yīng)，造成L*值的降低，調(diào)味魚(yú)顏色變暗。a*和b*值的降低可能是調(diào)味魚(yú)中色素降解等因素與美拉德反應(yīng)綜合作用的結(jié)果[13]。

表1 殺菌過(guò)程對(duì)調(diào)味魚(yú)顏色變化及美拉德反應(yīng)關(guān)聯(lián)值的影響Table 1 Effect of sterilization process on color change and correlation value of Maillard reaction of seasoned fish

由表2可知，隨著L-半胱氨酸添加量的增加，調(diào)味魚(yú)的L*、a*、b*、ΔE值先增加后趨于平穩(wěn)，相比于空白組均有顯著提高(P<0.05)，這與WEI等[14]的研究結(jié)果一致。添加檸檬酸后，調(diào)味魚(yú)的L*、b*、ΔE值相比于空白組有顯著提高，但a*值沒(méi)有顯著性差異。添加D-異抗壞血酸鈉后，調(diào)味魚(yú)的L*、ΔE值相比于空白組有顯著提高，但不同添加量之間沒(méi)有顯著性差異，a*、b*值與空白組沒(méi)有顯著性差異。由此可見(jiàn)，適量添加3種護(hù)色劑可以提高殺菌后調(diào)味魚(yú)的整體明亮度。以總色差為依據(jù)，L-半胱氨酸、檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉的最適添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為0.3%、0.4%、0.1%。整體來(lái)看，半胱氨酸作為護(hù)色劑的效果最好。

表2 不同添加量的護(hù)色劑對(duì)殺菌后調(diào)味魚(yú)顏色變化的影響Table 2 Effect of color protectant on color change of seasoned fish after sterilization

2.2 pH值的變化

pH是美拉德反應(yīng)的重要影響因素，主要作用于美拉德反應(yīng)初始階段的羰氨縮合和高級(jí)階段Amadori產(chǎn)物的降解。pH在3～10時(shí)，美拉德反應(yīng)速率隨著pH的增加而增加。pH通過(guò)影響還原糖的結(jié)構(gòu)以改變其美拉德反應(yīng)性。當(dāng)pH≤7時(shí)，Amadori產(chǎn)物更容易發(fā)生1,2-烯醇化反應(yīng)[15-16]。由表1和圖1可知，殺菌后調(diào)味魚(yú)體系pH幾乎不變，在5.9左右，呈微酸性。半胱氨酸的加入對(duì)體系的pH影響不大，添加D-異抗壞血酸鈉使pH略有升高。隨著檸檬酸添加量的增加，調(diào)味魚(yú)pH呈線(xiàn)性降低，體系pH從5.87降至5.50。

圖1 不同添加量的護(hù)色劑對(duì)殺菌后調(diào)味魚(yú)pH的影響Fig.1 Effect of color protectant on pH of seasoned fish after sterilization

2.3 護(hù)色劑對(duì)調(diào)味魚(yú)還原糖含量的影響

還原糖是美拉德反應(yīng)的羰基供體，高溫殺菌過(guò)程中引起其含量變化的反應(yīng)主要有多糖水解、已糖脫水及美拉德反應(yīng)[15, 17]。由表1可知，調(diào)味魚(yú)中主要的還原糖是葡萄糖和果糖，且葡萄糖含量高于果糖。殺菌后葡萄糖含量降低了44.4%，果糖含量幾乎不變。由于醛糖容易形成Amadori重排產(chǎn)物，褐變速度快；酮糖更易形成Heyns重排產(chǎn)物，褐變速度相對(duì)較慢，且調(diào)味魚(yú)中葡萄糖含量高，所以，殺菌過(guò)程中參與美拉德褐變的還原糖主要是葡萄糖。由圖2可知，隨著L-半胱氨酸添加量的增加，葡萄糖含量先增加后迅速降低，各添加量均顯著高于空白組(P<0.05)。果糖含量相比葡萄糖變化幅度較小。有研究表明，氨基酸促進(jìn)了多糖的水解，造成還原糖含量的增加[2]。同時(shí)半胱氨酸作為還原性氨基酸，可能低添加量時(shí)，主要與Amadori產(chǎn)物反應(yīng)，不會(huì)引起還原糖的額外消耗；過(guò)量的半胱氨酸會(huì)作為初始反應(yīng)物消耗還原糖，導(dǎo)致葡萄糖含量的減少[8, 18]。隨著檸檬酸添加量的增加，葡萄糖含量先平穩(wěn)再增加至顯著高于空白組。果糖含量先穩(wěn)定后略增加。美拉德初始階段可逆，酸促進(jìn)羰氨縮合產(chǎn)物的解離，而且酸減少了還原糖的開(kāi)鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)，降低了糖的反應(yīng)性，從而減少還原糖的利用，造成還原糖含量的增加[16, 19]。隨著D-異抗壞血酸鈉添加量的增加，葡萄糖含量先增加后趨于平穩(wěn)，各添加量均顯著高于空白組。果糖含量變化幅度較小。D-異抗壞血酸鈉可以清除美拉德反應(yīng)中的自由基，并且可以和中間產(chǎn)物反應(yīng)，抑制美拉德反應(yīng)的進(jìn)行；同時(shí)部分以其異構(gòu)體抗壞血酸形式存在，抗壞血酸的性質(zhì)類(lèi)似于糖，但不需要氨基即可發(fā)生自氧化，產(chǎn)物可進(jìn)入美拉德反應(yīng)，減少葡萄糖的消耗[19-20]。葡萄糖含量及美拉德反應(yīng)活性高，所以護(hù)色劑的添加主要引起了葡萄糖含量的變化。果糖含量及反應(yīng)活性相對(duì)較低，變化幅度較小。但果糖的美拉德反應(yīng)常伴隨著果糖的焦糖化，可能會(huì)造成果糖的消耗[17]。

a-葡萄糖含量;b-果糖含量圖2 不同添加量的護(hù)色劑對(duì)殺菌后調(diào)味魚(yú)葡萄糖和果糖含量的影響Fig.2 Effect of color protectant on glucose and fructose content of seasoned fish after sterilization

2.4 護(hù)色劑對(duì)調(diào)味魚(yú)5-HMF含量的影響

5-HMF是一種具有呋喃環(huán)的糠醛化合物，是美拉德反應(yīng)高級(jí)階段的重要產(chǎn)物，同時(shí)是已糖脫水和抗壞血酸氧化的共同產(chǎn)物[21]。在美拉德反應(yīng)中主要由Amadori產(chǎn)物通過(guò)1，2-烯醇化途徑生成，果糖在酸性環(huán)境中脫水可直接生成5-HMF，而葡萄糖需先轉(zhuǎn)化為果糖再進(jìn)行脫水反應(yīng)[22]。由表1可知，殺菌后，5-HMF含量增加了47.4%，表明調(diào)味魚(yú)中積累了一定量的美拉德中間產(chǎn)物。隨著L-半胱氨酸添加量的增加，5-HMF的含量先降低后緩慢增加，各添加量均顯著低于空白組(P<0.05)。由圖3可知，半胱氨酸可以和其他氨基酸的Amadori產(chǎn)物反應(yīng)，進(jìn)而阻止其通過(guò)1，2-烯醇化途徑生成5-HMF。添加量過(guò)高時(shí)，可能會(huì)形成自身的Amadori產(chǎn)物，造成5-HMF的積累，但半胱氨酸相比于其他氨基酸生成的5-HMF含量較低[8, 23]。隨著檸檬酸添加量的增加，5-HMF含量先迅速降低后緩慢增加至與空白組持平。酸可以促進(jìn)羰氨縮合產(chǎn)物N-葡萄糖胺水解，減少進(jìn)一步生成5-HMF；但使更大比例的Amadori產(chǎn)物通過(guò)1，2-烯醇化途徑生成5-HMF，且果糖可直接脫水生成5-HMF，可能造成了5-HMF的增加[7, 22]。隨著D-異抗壞血酸鈉添加量的增加，5-HMF含量先迅速降低再增加至顯著高于空白組?？赡艿吞砑恿繒r(shí)，還原作用占主導(dǎo)，抑制美拉德反應(yīng)。高添加量時(shí)，在密封包裝的缺氧條件下，抗壞血酸與水反應(yīng)生成2,3-二酮古洛糖酸，再進(jìn)一步脫羧脫水生成呋喃醛等物質(zhì)，造成5-HMF含量的持續(xù)增加[21]。

圖3 不同添加量的護(hù)色劑對(duì)殺菌后調(diào)味魚(yú)5-HMF含量的影響Fig.3 Effect of color protectant on 5-HMF content of seasoned fish after sterilization

2.5 護(hù)色劑對(duì)調(diào)味魚(yú)美拉德反應(yīng)程度的影響

熒光物質(zhì)主要由還原性化合物重組或氨基化合物Strecker降解形成，反映了美拉德反應(yīng)的早期過(guò)程[16]。由表1可知，殺菌后熒光強(qiáng)度增加了38.7%，表明美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物的積累。隨著L-半胱氨酸添加量的增加，熒光強(qiáng)度降低后趨于平穩(wěn)，各添加量均顯著低于空白組(P<0.05)。半胱氨酸作用于Amadori產(chǎn)物，阻止其進(jìn)一步生成脫氧還原酮及環(huán)化，從而影響熒光化合物的產(chǎn)生[8]。隨著檸檬酸添加量的增加，熒光強(qiáng)度下降至顯著低于空白組后緩慢回升。酸抑制了美拉德反應(yīng)初始階段的羰氨縮合，并使Amadori產(chǎn)物更易發(fā)生1，2-烯醇化，減少2，3-烯醇化途徑生成的還原酮類(lèi)物質(zhì)，從而影響熒光強(qiáng)度，這與GENG等[12]的研究結(jié)果相似。隨著D-異抗壞血酸鈉添加量的增加，熒光強(qiáng)度先降低后持續(xù)增加至顯著高于空白組?？赡苁堑蜐舛鹊漠惪箟难徕c還原作用占主導(dǎo)，而高濃度時(shí)自身氧化促進(jìn)了美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的增加。這與劉紅[24]的研究結(jié)論相似，其研究表明美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度隨著抗氧化劑濃度的增加而增加。

在波長(zhǎng)294 nm處的吸光值與美拉德反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的無(wú)色中間產(chǎn)物有關(guān)，如糖、醛、小分子酮等[15]。由表1可知，殺菌后A294略有增加。隨著L-半胱氨酸添加量的增加，A294降低后趨于平穩(wěn)，且均顯著低于空白組(P<0.05)。半胱氨酸具有還原性，可以和共軛系統(tǒng)發(fā)生加成反應(yīng)，改變中間產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，也可以通過(guò)與Amadori產(chǎn)物反應(yīng)影響中間產(chǎn)物的生成，從而改變294 nm處的吸光值[3]。添加檸檬酸后，A294顯著低于空白組，但各添加量之間沒(méi)有顯著性差異。低pH可以抑制美拉德反應(yīng)的初始階段，同時(shí)檸檬酸根可以螯合金屬離子，減少其對(duì)Amadori產(chǎn)物自氧化的催化作用，從而減少中間產(chǎn)物的生成[3]。隨著D-異抗壞血酸鈉的添加量增加，A294呈增加后降低再增加的波動(dòng)趨勢(shì)。D-異抗壞血酸鈉可以對(duì)甲基乙二醛等活性羰基化合物進(jìn)行修飾，同時(shí)自身氧化可以產(chǎn)生還原酮等美拉德中間產(chǎn)物[20, 25]。A294的波動(dòng)趨勢(shì)可能是這2種反應(yīng)綜合作用的結(jié)果。

在波長(zhǎng)420 nm處的吸光值表示褐變度，與美拉德反應(yīng)最終階段生成的褐變產(chǎn)物(類(lèi)黑精)有關(guān)[15]。由表1可知，殺菌后A420增加了60.0%，調(diào)味魚(yú)發(fā)生了較明顯的褐變。隨著L-半胱氨酸添加量的增加，A420先穩(wěn)定后增加至顯著高于空白組(P<0.05)。低濃度時(shí)半胱氨酸與其他氨基酸的Amadori產(chǎn)物反應(yīng)減少褐變物質(zhì)的生成，高濃度時(shí)可能生成了自身的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，導(dǎo)致呈色物質(zhì)積累。不同氨基酸的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有不同的顏色特征，且半胱氨酸的加入改變了調(diào)味魚(yú)中糖和氨基酸的比例，也會(huì)對(duì)褐變度造成影響[26]。隨著檸檬酸添加量的增加，A420降低趨于平緩后緩慢增加，但均顯著低于空白組。酸抑制美拉德反應(yīng)初始階段，且使Amadori產(chǎn)物更容易發(fā)生1，2-烯醇化。有研究表明，2，3-烯醇化是美拉德反應(yīng)色素物質(zhì)生成的主要途徑[16]。這與GENG等[12]的研究結(jié)果一致，其研究表明pH 6.0 的魷魚(yú)褐變度顯著高于pH 5.5。但也有研究表明，檸檬酸具有一定緩沖能力，可以加速褐變[24]。隨著D-異抗壞血酸鈉添加量的增加，A420先降低至顯著低于空白組，后增加至顯著高于空白組。添加量較低時(shí)，主要通過(guò)對(duì)活性羰基化合物等的修飾減少呈色物質(zhì)的積累，抑制體系的褐變反應(yīng)。添加量較高時(shí)，自身氧化產(chǎn)物進(jìn)入美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致褐變度增加[25]。

a-熒光強(qiáng)度;b- A420(實(shí)線(xiàn))和A294(虛線(xiàn))圖4 不同添加量的護(hù)色劑對(duì)殺菌后調(diào)味魚(yú)美拉德反應(yīng)程度的影響Fig.4 Effects of color protectants on the reaction degree of seasoned fish Maillard after sterilization

3 結(jié)論

殺菌后，調(diào)味魚(yú)的L*、a*、b*、ΔE值均降低，調(diào)味魚(yú)顏色變暗。適量添加L-半胱氨酸、檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉可以提高殺菌后調(diào)味魚(yú)色差值，最適添加量分別為0.3%、0.4%、0.1%。其中，L-半胱氨酸作為護(hù)色劑的效果最好。殺菌過(guò)程發(fā)生了美拉德反應(yīng)，消耗了葡萄糖，生成了5-HMF，增加了熒光強(qiáng)度、A294和A420。半胱氨酸可以和還原糖或中間產(chǎn)物反應(yīng)，降低了5-HMF含量、熒光強(qiáng)度和A294，但高濃度時(shí)導(dǎo)致A420增加。檸檬酸減少葡萄糖的利用，降低了5-HMF含量、熒光強(qiáng)度、A294和A420。D-異抗壞血酸鈉低濃度時(shí)抑制，高濃度時(shí)促進(jìn)美拉德反應(yīng)，5-HMF含量、熒光強(qiáng)度、A294和A420隨添加量的增加先降后增。添加護(hù)色劑，影響了美拉德反應(yīng)物的利用和產(chǎn)物的生成，從而改變了調(diào)味魚(yú)的顏色，但不排除色素降解等其他因素對(duì)顏色變化影響的可能性，還有待進(jìn)一步研究。