許贛榮，邢宏博,倪冬姣,4，張薄博，陳磊，鄒新華，3*

1(江南大學(xué)，江蘇 無錫， 214000)2(佛山播恩生物科技有限公司，廣東 佛山， 528100) 3(播恩生物技術(shù)股份有限公司，江西 贛州， 341000)(4 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 生物飼料重點實驗室，江西 贛州， 341000)

紅曲色素，是利用微生物發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)的成功典范[1-2]。其中紅曲紅色素的生產(chǎn)及應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)成熟[3-7]。近年來，人們對紅曲黃、橙色素的研究正在不斷深入，這包括對紅曲黃、橙色素發(fā)酵、分離純化及定性、定量檢測方法的研究[8-13]。

紅曲色素的分離、定性及定量檢測工作，難度極大。原因是，首先，紅曲發(fā)酵的色素產(chǎn)品，皆是多種色素與發(fā)酵基質(zhì)殘余物的混合物，純色素的制備難度大。其次，紅曲色素種類繁多[14-15]， 已有94種紅曲色素被報導(dǎo)，其中有44種黃色素，8種橙色素以及42種紅色素[16]。而且這些色素的分子結(jié)構(gòu)式相近，采用一般的方法無法純化，故定性及定量也就困難重重。色素含量的檢測方法，國內(nèi)外有研究者[17-18]曾經(jīng)使用過高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)法或色素的質(zhì)量濃度法進行定量測定，但這需要預(yù)先獲得純色素，工作量巨大。

紅曲產(chǎn)業(yè)界普遍采用分光光度計法，在特定波長下檢測色素萃取物的OD值，計算色素的色價，并以色價值的大小作為色素含量高低的依據(jù)。例如，國家標(biāo)準(zhǔn)中，紅曲紅是在505 nm下檢測；紅曲黃在466～486 nm檢測[19-21]。天然紅曲黃色素，往往又在320～420 nm下測定。如果樣品中含有眾多紅曲色素，分光光度計的檢測方法也有缺陷，即在固定的波長下檢測色價值，并不能精確地反映色素的種類及定量。因為眾多色素的特征波長的數(shù)據(jù)還未測定過；而且多種色素混合物的掃描圖譜中，峰值所對應(yīng)的波長會發(fā)生移動。只有對高純度的色素樣品，才能用分光光度計法進行精確的定性和定量。誠然，用制備型高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的方法可以徹底解決問題。但這也需要大量的分離純化工作及高端儀器為依托。ZHENG等[22]的文獻報道，采用HPLC-FD/PAD和MS聯(lián)用的方法，研究紅曲產(chǎn)品指紋特征性物質(zhì)，據(jù)稱檢測到8種已知色素產(chǎn)品(紅、橙色素各2種，黃色素4種)，還有2個未知產(chǎn)物。用該法可以確定色素的分子量，顯然對于物質(zhì)定性是有極大幫助的，但有不少紅曲色素物質(zhì)尚未分離純化，其分子結(jié)構(gòu)式未知，峰值波長也不確定，用HPLC法還是不夠的。

本研究采用紫色紅曲菌W-2發(fā)酵液為研究對象，采用板層析分離及分光光度計掃描檢測相結(jié)合的方法，對紅曲色素進行初步的分離定性和定量的研究，試圖找出一種簡單而實用的橙、黃色素的定性及定量檢測方法，為進一步研究紅曲色素的特性打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紫色紅曲菌W-2，由江南大學(xué)提供；紅曲發(fā)酵液，由100 L機械攪拌通風(fēng)罐生產(chǎn)，發(fā)酵液中包含菌體且富含各種色素，外觀呈橙黃色。如圖1所示。乙醇、甲苯、乙酸乙酯、甲酸，皆為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M離心機,湖南湘儀；UV1600紫外-可見比例雙光束分光光度計；P-1型 (200×200) cm層析缸,壘固科技有限公司；層析板：60 F254，25 Aluminium sheets (20×20) cm TLC 硅膠,Merck公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵液的萃取和離心分離

在發(fā)酵液中加入其體積15%的脂溶性萃取劑，離心分離，8 000 r/min，20 min；離心后發(fā)酵液分為上層相、中間層與水相3個不同層次。

1.3.2 用分光光度計檢測紅曲色素的特征波長及色價

色價定義為單位質(zhì)量(g)或單位體積(mL)的色素樣品，用合適的溶劑萃取并稀釋后，在分光光度計中，用1 cm比色皿，在一定波長下測得的吸光度值(OD)乘以其稀釋倍數(shù)。色價單位分別是U/g或U/mL。

上層萃取相色素：取上層相1 mL，加49 mL無水乙醇萃取色素，8 000 r/min，離心10 min后，用無水乙醇稀釋后在300～600 nm掃描，確定波峰所對應(yīng)的波長，并計算萃取相色價。

中間層色素：同上層相的方法。

下層水相色素：用移液槍，取離心管下層水相2 mL置于50 mL比色管中，用無水乙醇稀釋，8 000 r/min，10 min離心后在300～600 nm掃描，確定波峰值所對應(yīng)的波長，并計算下層水相色價。

色價的計算如公式(1)、公式(2)所示：

(1)

式中：引入萃取相體積/水相體積這個系數(shù)，是要將萃取相中的色價統(tǒng)一折算為水相的色價。

水相色價/(U·mL-1)=ODmax×總稀釋倍數(shù)

(2)

1.3.3 色素萃取液的薄層層析分離方法

乙醇萃取的色素樣品，用毛細管點樣，層析板置于層析缸中展開，展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=7∶3∶1(體積比)。層析板(20×20) cm,展開后，溶劑前沿離層析板頂端2 cm左右時取出層析板，記錄展開劑前沿的位置，將板晾干后在可見光下觀察。比移值(Rf值)計算方法如公式(3)所示：

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液及其離心處理

紅曲發(fā)酵液外觀如圖1所示。發(fā)酵液稀釋后，用分光光度計在300～600 nm掃描，掃描圖譜如圖2所示。發(fā)酵液黃色素的最高色價 531 U/mL(406 nm)；橙色素色價(466 nm)439 U/mL。從圖2中的2個波峰對應(yīng)的波長可看出，色素中主要含有黃色素和橙色素。

圖1 紫色紅曲菌W-2發(fā)酵液外觀Fig.1 Fermentation broth of Monascus purpureus W-2

圖2 發(fā)酵液乙醇提取物的分光光度計掃描圖Fig.2 Scanning curve of ethanol extract of fermentation broth

在發(fā)酵液中加入脂溶性萃取劑(占發(fā)酵液體積的15%～30%)，離心后，呈現(xiàn)上、中、下三相。如圖3所示，上部為萃取劑層，色素含量高，為非水溶性色素；下層為水相層，所含色素主要是水溶性色素；中間層含有菌體，其中夾雜有大量的色素。

圖3 發(fā)酵液離心后的分層情況Fig.3 Three phases are shown in the fermentation broth after centrifugation注：上層為萃取相；下層為水相；中間層為菌體及其所含的色素

圖4分別是上層萃取相、中間層和下層水相用乙醇稀釋后液體的外觀。從其顏色來看，上層相的和下層相的乙醇稀釋液呈黃色，中間層的則呈橙色。

圖4 上層萃取相、中間層和下層水相用乙醇稀釋后的外觀Fig.4 Diluted solution of the three phases with ethanol

2.2 三相色素300～600 nm可見光范圍內(nèi)的掃描圖及其特征

發(fā)酵液離心分離后所展示的3個層相，分別取樣，用乙醇萃取或稀釋后，用分光光度計在300～600 nm進行掃描，如圖5所示。

圖5 紅曲色素提取液在300～600 nm的掃描圖Fig.5 Scanning curves of the ethanol extracts of the pigments from the three phase注：水相層峰值波長，332 nm； 中間相層峰值波長408、468 nm；萃取相層峰值波長，391、468 nm

由圖5可知，上層萃取相層色素的波峰對應(yīng)波長是391 nm，說明是黃色素；在468 nm處有一轉(zhuǎn)折峰，說明萃取相中有少量橙色素；在中間層，2個峰所對應(yīng)波長分別是408和468 nm，色價幾乎相同，說明中間層相中主要是黃色素和橙色素。下層水相中主要是黃色素，但其波峰所對應(yīng)波長是332 nm，該色素和上層相及中間層的黃色素有所不同；在468 nm處，有一轉(zhuǎn)折峰，說明水相中也有少量橙色素；據(jù)圖5掃描圖中的3條曲線，可以初步認為，發(fā)酵液中至少有3種黃色素：其波峰所對應(yīng)波長分別在332、 391和408 nm。發(fā)酵液中也有橙色素，其特征吸收峰所對應(yīng)的波長在468 nm處，而且橙色素主要分布在中間層。

圖5所顯示的3種紅曲色素提取液在300～600 nm的掃描圖譜的峰值所對應(yīng)的特征波長，進一步證實了圖4所顯示的3種紅曲色素提取液外觀顏色。依據(jù)色素產(chǎn)品的外觀顏色及掃描圖形特征，可以大體上判斷其色調(diào)的類型(紅、黃、橙、紫等色調(diào))，即對色素的色調(diào)進行初步定性。但從外觀顏色及掃描圖均無法準(zhǔn)確得知是哪種色素。

2.3 色素萃取液的板層析分離

用板層析法對圖3所示的三相色素提取液進行了展開。同時做了1種紅曲米萃取液。如圖6所示,條帶1的上層萃取相和條帶2的中間相的色素條帶很多，橙、黃、紅三類色素都有，但主要是橙色素和黃色素。條帶3的下層水相主要是黃色素，但相對含量均較低，下層水相中沒有紅色素，但有水溶性橙色素(未上移)。紅曲米的萃取液中含有大量的紅色素或紫紅色素條帶，同時含有橙、黃色素。

縱觀層析板上的色帶，紫色紅曲菌W-2發(fā)酵液中至少有橙色素10種，黃色素13種。圖6所示的上層萃取相的色素種類最多，在可見光下其肉眼可見的色素條帶至少有20種;中間層相的色素條帶至少有13種；上層萃取相和中間相，相對含量較多的是2種橙色素，即編號為21和23的色素條帶，其Rf值分別為0.604和0.642(表1)。

1-上層萃取相色帶； 2-中間層相色帶;3-下層水相色帶；4-紅曲米萃取液色帶圖6 紅曲色素的板層析Fig.6 Thin layer Chromatography of the Monascus pigments

表1 色素板層析分離的有關(guān)數(shù)據(jù)Table 1 Rf values of the pigments in the thin layer chromatography

3 結(jié)論

根據(jù)上述實驗結(jié)果，可以得出以下結(jié)論：

(1)無論是固態(tài)還是液態(tài)發(fā)酵，紅曲菌產(chǎn)生多種色素。有水溶性色素，更多的則是油溶性色素，本實驗紫色紅曲菌的發(fā)酵液中含有較豐富的黃色素，其次是橙色素，大多是醇溶性。

(2)當(dāng)色素稀釋后可根據(jù)肉眼觀察色素的顏色，并初步判斷其色調(diào)(紅、橙或黃色)。

(3)根據(jù)可見光300～600 nm光譜掃描圖的特征，可大致區(qū)別色素的種類，并可以對色素的相對含量作出計算，但嚴格來說想要用分光光度計法來進行準(zhǔn)確的定性和定量檢測，是不夠的。

(4)板層析法可以直接觀察到樣品中色素的類型(色調(diào))及其種類，并可計算其比移值，從而對每一種色素進行初步的定性，并對每一種色素的相對含量作出評估。

(5)板層析法和分光光度計法相結(jié)合，也許是目前對色素進行初步定性及定量的較簡便實用方法。