馬慧敏，馮鋼

（1. 皖南醫(yī)學(xué)院研究生院，安徽 蕪湖 241002；2. 皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院檢驗科）

大量基因組測序和轉(zhuǎn)錄組分析的研究表明，人類轉(zhuǎn)錄組不僅包括蛋白編碼RNA，還包括大量的非編碼 RNA［1］。非編碼 RNA 根據(jù)其長度分為長、短兩種。microRNA（miRNA）是目前研究最多的短非編碼RNA，在多種癌癥中表達(dá)不同，其種子序列與 mRNA 的 miRNA 應(yīng)答元件（miRNA response element，MRE）之間的堿基配對可抑制mRNA 翻譯并介導(dǎo) mRNA 衰減［2］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）被廣泛定義為長度超過200 個核苷酸的非編碼 RNA［3］。越來越多的研究報道，lncRNA 可以作為競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），與miRNA 的MRE 結(jié)合，保護(hù)目標(biāo)mRNA 轉(zhuǎn)錄物不被降解。根據(jù) ceRNA 理論，一些 lncRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)在一些人類腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，包括卵巢癌、肺腺癌和頭頸鱗癌［4-6］。lncRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)的發(fā)現(xiàn)為我們進(jìn)一步了解腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移提供了重要線索［7-9］。

腎癌是泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率最高的腫瘤之一。腎透明細(xì)胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）是腎癌中最常見的亞型，是一種惡性侵襲性腎癌，預(yù)后不良［10］。過去，人們一直致力于研究KIRC 生物標(biāo)志物，以提高KIRC 患者的早期診斷和預(yù)后，但近年來研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍拙幋a基因或 miRNA［11-13］。有研究報道 lncRNA 在KIRC 中異常表達(dá)［14-15］，但 lncRNA 在 KIRC 中的臨床意義和生物學(xué)作用尚未得到充分研究。

癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫為分析不同基因組改變的高通量數(shù)據(jù)提供了便利，包括非編碼RNA。本研究從TCGA 數(shù)據(jù)庫中獲取了KIRC 患者的 lncRNA、miRNA 和 mRNA 的表達(dá)譜，利用edgeR 工具包檢測 KIRC 中差異表達(dá)的 lncRNA、miRNA 和mRNA，通過權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）選擇與臨床信息相關(guān)的lncRNA 模塊。為了闡明lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 網(wǎng)絡(luò)中的交互作用，我們利用生物信息學(xué)分析預(yù)測了lncRNA-miRNA之間的相互作用，以及 miRNA-mRNA 之間的相互作用，同時利用TCGA KIRC 數(shù)據(jù)集和 KIRC 的臨床樣本，驗證了 lncRNA 在ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 TCGA KIRC 數(shù)據(jù)集 從TCGA 下載了mRNA表達(dá)芯片（72 個正常組織，539 個腫瘤組織）和miRNA 表達(dá)芯片（71 個正常組織，545 個腫瘤組織），網(wǎng)址為 https://portal.gdc.cancer.gov／，同時下載并提取 KIRC 患者相應(yīng)的臨床信息。lncRNA表達(dá)譜的鑒定根據(jù)GENCODE 的注釋確定，網(wǎng)址為 http://www.gencodegenes.org。由于 TCGA數(shù)據(jù)（TCGA_KIRC_exp_HiSeqV2-2015-02-24）是公開的，我們的研究完全符合TCGA 提供的發(fā)布指南，因此不需要獲得當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會的額外批準(zhǔn)。

1.2 KIRC 中 差 異 表 達(dá) 的 mRNA、miRNA 和lncRNA的鑒定 使用 edgeR 工具包檢測 TCGA KIRC 數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)的 mRNA、miRNA 和lncRNA［16］，閾值設(shè)置為 log2（腫瘤組織／正常組織）≥2，偽發(fā)現(xiàn)率＜ 0.01。

1.3 權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用WGCNA R包把所有差異表達(dá)的lncRNA 納入權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析［17］，根據(jù)無尺度網(wǎng)絡(luò)分布，軟件自動篩選的軟閾值選擇與KIRC 患者臨床信息最相關(guān)的lncRNA 模塊進(jìn)行進(jìn)一步探討。

1.4 驗證lncRNA 的臨床作用 通過受試者工作特征（ROC）曲線評估所選模塊中所有l(wèi)ncRNA 的診斷效能，通過 Spearman 相關(guān)分析探討 lncRNA表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系，采用Kaplan-Meier法檢測這些lncRNA 的預(yù)后作用，并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗。我們還對這些lncRNA 進(jìn)行了單因素和多因素Cox 回歸分析。雙側(cè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計分析均采用 SPSS 13.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）軟件進(jìn)行。

1.5 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 MiRcode 測定lncRNA-miRNA的相互作用，網(wǎng)址為 http://www.mircode.org／［18］，從 miRTarBase、TargetScan、miRDB 中 檢 索 到miRNA的靶向 mRNA，網(wǎng)址分別為http://mirtarbase.mbc. nctu. edu. tw ／、http://www. targetscan. org／vert_71／、http://www.mirdb.org／。利用 Cytoscape v3.6.1 構(gòu)建 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行可視化［19］。

1.6 基于KIRC 的臨床樣本驗證ceRNA 網(wǎng)絡(luò)中的lncRNA 為了進(jìn)一步驗證TCGA 數(shù)據(jù)庫中l(wèi)ncRNA的作用，利用RT-qPCR 檢測了臨床樣本中l(wèi)ncRNA的表達(dá)，收集 33 例 2018 年 1 月至 2018 年 7 月在皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院行無輔助治療的腎切除術(shù)（根治性或部分性）患者的癌組織和癌旁組織標(biāo)本。本研究經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院倫理委員會審核通過，并獲得所有參與者的知情同意。相對表達(dá)式計算使用 2ΔCT方法［ΔCT ＝ CT（β-actin）-CT（目標(biāo)基因）］。引物序列見表 1。配對t檢驗比較癌組織和癌旁組織lncRNA 的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 KIRC 中差異表達(dá)的 lncRNA、miRNA 和mRNA 通過對lncRNA 表達(dá)譜的分析，共發(fā)現(xiàn)了1 821 個差異表達(dá)的lncRNA，其中包括1 211 個上調(diào)表達(dá)的 lncRNA 和 610 個下調(diào)表達(dá)的 lncRNA（圖1）。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了27 個上調(diào)表達(dá)和29個下調(diào)表達(dá)的 miRNA，以及1 587 個上調(diào)表達(dá)和799 個下調(diào)表達(dá)的mRNA。

表1 引物序列

圖1 癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)的lncRNAs

2.2 權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵模塊的識別 為了得到差異表達(dá)的lncRNA 的功能簇，我們使用WGCNA 進(jìn)行了基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，權(quán)重參數(shù) β ＝3（scale-free R2＝ 0.95），最小模塊大小設(shè)定為30。共檢測到7 個模塊（圖2A），分別為藍(lán)色、棕色、綠色、灰色、紅色、藍(lán)綠色和黃色，這些模塊中 lncRNA 的數(shù)量分別為 109、90、57、154、41、361 和 89。如圖 2B 所示，藍(lán)色模塊與病理分期（cor＝ 0.314，P＜0.01）、轉(zhuǎn)移（cor＝0.224，P＜0.01）、分級（cor＝ 0.396，P＜0.01）相關(guān)性最好。

圖2 權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵模塊的識別

2.3 藍(lán)色模塊中l(wèi)ncRNA 的臨床價值 如表2 所示，藍(lán)色模塊中有15 個lncRNA 的ROC 曲線下面積在0.9 以上，提示這些lncRNA 可能在KIRC 的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用，并對KIRC 患者具有較高的診斷價值，lncRNA 和臨床病理之間的關(guān)系見表3。AC004817.3、AC009549.1、AC011352.1、AC011352.3、AC019069.1、AC114803.1、AC156455.1、AL161937.2、LINC00475、LINC01358、LINC01615、LUCAT1 和NPSR1-AS1 可以預(yù)測KIRC 患者病理分期為晚期分 期。AC004817.3、AC009549.1、AC011352.1、AC011352.3、AC019069.1、AC114803.1、AC156455.1、AL161937.2、AL355102.4、LINC00475、LINC01358、LINC01615 和 LUCAT1 可以辨別高病理分級的KIRC 患者。單因素 Cox 分析顯示，AC004817.3、AC009549.1、AC011352.1、AC011352.3、AC156455.1、AL161937.2、AL355102.4、LINC00475、LINC01615、LUCAT1、NPSR1-AS1 與 KIRC 患者的總體生存期相關(guān)，多因素 Cox 分析顯示，AL161937.2 和 LUCAT1 可能是 KIRC 的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)（P＝ 0.032，P＝0.019），見表 4。如圖 3A、3B 所示，Kaplan-Meier 分析顯示，高表達(dá) AL161937.2 和 LUCAT1的KIRC 患者的總體生存期明顯低于低表達(dá)AL161937.2 和 LUCAT1 的 KIRC 患者（P均 ＜0.01）。

表2 具有KIRC 重要診斷價值的lncRNA 分析結(jié)果

表3 lncRNA 的表達(dá)與KIRC 的臨床病理因素的關(guān)系

2.4 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過MiRcode 一共預(yù)測到5 個靶向 AL161937.2 的 miRNA 和 39 個靶向 LUCAT1 的 miRNA。之后，我們根據(jù) ceRNA 機(jī)制選擇了 6 個下調(diào)表達(dá)的 miRNA。通過 TargetScan、miRDB、miRTarBase 等工具進(jìn)一步預(yù)測這 6 種miRNA 的39 個上調(diào)表達(dá)的靶基因。最后，我們使用 2 個 lncRNA、6 個 miRNA 和 39 個 mRNA 構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，見圖 4。

2.5 臨床樣本驗證ceRNA 網(wǎng)絡(luò)中l(wèi)ncRNA 的臨床意義 在 33 例配對的 KIRC 組織樣本中，AL161937.2 在癌組織中的平均表達(dá)水平（0.012±0.009）明顯高于其癌旁組織（0.004±0.002）（P＜0.01，圖 5A），AUC 為 0.898（P＜ 0.01，圖5B）。LUCAT1 在癌組織中的平均表達(dá)水平（0.021±0.015）明顯高于其癌旁組織（0.006±0.004）（P＜0.01，圖 5D），AUC 為 0.924（P＜0.01，圖 5E）。如圖 5C 和 5F 所示，AL161937.2和LUCAT1 的高表達(dá)與KIRC 的晚期病理分期和病理高分級相關(guān)。

表4 單因素和多因素分析預(yù)測KIRC 患者的總體生存期

圖 4 lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 網(wǎng)絡(luò)

圖5 臨床樣本驗證ceRNA 網(wǎng)絡(luò)中l(wèi)ncRNA 的臨床意義

3 討論

已有報道稱lncRNA 在腎癌中異常表達(dá)，提示其可能作為癌基因或腫瘤抑制因子［20-21］。此外，也有研究表明，lncRNA 可能適用于KIRC 的診斷，甚至用于預(yù)測預(yù)后［22-23］。雖然在 KIRC 中有學(xué)者研究了單個lncRNA，但基于高通量RNA-seq 數(shù)據(jù)的研究鮮有報道。本研究利用TCGA 數(shù)據(jù)庫中的基因表達(dá)芯片對KIRC 的差異表達(dá)mRNA、miRNA和lncRNA 進(jìn)行了鑒定，所有差異表達(dá)的lncRNA被用來構(gòu)建權(quán)重共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，通過WGCNA 本研究共鑒定出7 個模塊。其中藍(lán)色模塊與腫瘤分期和分級的相關(guān)性最好，藍(lán)色模塊中的 109 個lncRNA，15 個 lncRNA 對 KIRC 的診斷價值極高，其AUC 均大于0.90。這些lncRNA 的表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系也通過Spearman 相關(guān)檢驗得到了驗證，進(jìn)一步支持了WGCNA 的結(jié)果。此外，生存分析表明，AL161937.2 和 LUCAT1 是 KIRC 患者的獨(dú)立預(yù)后因子，提示其預(yù)后價值。

到目前為止，只有少數(shù)研究報道了lncRNA 與mRNA，或 lncRNA 與 miRNA 在 KIRC 中的相互作用，關(guān)于KIRC 中ceRNA 交互作用的研究報道更少。根據(jù)ceRNA 假說，本研究通過生物信息學(xué)分析預(yù)測了lncRNA-miRNA 相互作用和miRNA-mRNA相互作用，并且構(gòu)建了一個包含 2 個 lncRNA（AL161937.2 和 LUCAT1）、6 個 miRNA 和 39 個mRNA 的 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)。

LncRNA AL161937.2（也稱 LOC101927512），位于染色體20q13.13。雖然目前還沒有文獻(xiàn)報道，但本研究發(fā)現(xiàn) AL161937.2 在臨床 KIRC 組織和TCGA KIRC 組織中均較正常組織有明顯上調(diào)。此外，AL161937.2 在本研究中被確定為KIRC 新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物?；趯?MiRcode 的預(yù)測，AL161937.2 有 3 個 MREs，可以與 5 個 miRNA 結(jié)合。在這些 miRNA 中，只有 hsa-miR-138-5p 在KIRC 組織中顯著下調(diào)［24］。有研究報道，hsa-miR-138-5p 的靶基因 VIM、TERT 和 ZEB2 在 KIRC組織中明顯上調(diào)［25-27］，并且 VIM、TERT、ZEB2和hsa-miR-138-5p 之間的相互作用分別被Yamasaki等［28］、Zhang 等［29］和 Ding 等［30］證實(shí)。因此，本研究推測當(dāng) AL161937.2 高表達(dá)時，hsa-miR-138-5p會被抑制，導(dǎo)致在KIRC 中VIM、TERT 和ZEB2 的表達(dá)增加。

位于 5q14.3 號染色體的 LncRNA LUCAT1（肺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄1）在非小細(xì)胞肺癌中首次被發(fā)現(xiàn)［31］。最近，已有報道稱 LUCAT1 在某些腫瘤中發(fā)揮作用［32-33］。本研究發(fā)現(xiàn) LUCAT1 在臨床 KIRC組織和TCGA KIRC 組織中均有上調(diào)，并與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，這與 Zheng 等［34］的報道一致。本研究通過MiRcode 預(yù)測了 39 個靶向 LUCAT1 的 miRNA，其中 hsa-miR-200c-5p、hsa-miR-506-5p、hsamiR-429、hsa-miR-363-5p、hsa-miR-141-5p 在TCGA KIRC 數(shù)據(jù)集中均有明顯的低表達(dá)［35-37］。已有研究報道，這些miRNA 的靶基因包括VEGFA、TIMP1 和 CXCL10 在 KIRC 中顯著上調(diào)［38-40］。此外，hsa-miR-200c-5p、hsa-miR-141-5p、hsa-miR-429、hsa-miR-200c-5p 與 VEGFA 的相互作用、hsa-miR-363-5p 與 TIMP1 的相互作用、hsamiR-200c-5p 與ZEB2 的相互作用已分別得到了前人研究的驗證［41-43］。這些結(jié)果表明，LUCAT1 可能與 hsa-miR-200c-5p、hsa-miR-506-5p、hsamiR-429、hsa-miR-363-5p 和 hsa-miR-141-5p產(chǎn)生競爭，從而調(diào)控 KIRC 中 VEGFA、TIMP1 和CXCL10 的表達(dá)。

在本研究中，我們利用TCGA KIRC 數(shù)據(jù)集中的大規(guī)模樣本，篩選到 2 個潛在的 KIRC 的 lncRNA 生物標(biāo)志物，并通過 RT-qPCR 驗證了2 種lncRNA 在 KIRC 中的表達(dá)。更重要的是，我們構(gòu)建了 lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，這為更好地理解KIRC 中的ceRNA 調(diào)控提供了新的視角。然而，我們的研究也有一些局限性。首先，我們在33 個臨床樣本中只驗證了2 個lncRNA 的表達(dá)，我們的研究結(jié)果是否可以推廣到一般人群還有待確定。其次，我們的研究并沒有驗證所有l(wèi)ncRNA與miRNA 之間的相互作用，lncRNA（AL161937.2和LUCAT1）在KIRC 中的功能作用還需要通過實(shí)驗進(jìn)一步驗證。