王兵兵，周正雄，金學榮，李江華，史仲平，康振

·生物育種與工藝優(yōu)化·

肝素C5異構(gòu)酶的表達優(yōu)化及分子改造

王兵兵1,2，周正雄1,2，金學榮1,2，李江華1,2，史仲平1,2，康振1,2

1 江南大學 生物工程學院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122 2 江南大學 生物工程學院 糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

肝素和硫酸乙酰肝素是一類應(yīng)用于臨床抗凝血的糖胺聚糖。肝素葡萄糖醛酸C5異構(gòu)酶(Heparosan-N-sulfate-glucuronate 5-epimerase，C5，EC 5.1.3.17) 是肝素和硫酸乙酰肝素合成過程中重要的修飾酶，催化N-硫酸化肝素前體(N-sulfoheparosan) 的D-葡萄糖醛酸(D-GlcA) 上5號位羧基翻轉(zhuǎn)生成L-艾杜糖醛酸(L-iduronic acid，L-IdoA)。文中以大腸桿菌為宿主對斑馬魚來源的肝素葡萄糖醛酸C5異構(gòu)酶基因進行重組表達優(yōu)化與分子改造。比較了3種不同的表達載體pET20b(+)、pET28a(+) 和pCold Ⅲ對C5表達的差異情況，其中以嗜冷啟動型載體pCold Ⅲ表達酶活最高，達到(1 873.61±5.42) U/L。為了進一步提高C5的可溶表達量，在N端融合促溶標簽SET2后，可溶蛋白表達量比對照提高了50%，酶活達到 (2 409.25±6.43) U/L。在此基礎(chǔ)上，通過理性設(shè)計對底物結(jié)合口袋進行定點突變，獲得最優(yōu)突變體(V153R)的酶活和比酶活分別為 (5 804.32±5.63) U/L和(145.14±2.33) U/mg，是原始酶的2.41倍和2.28倍。肝素C5異構(gòu)酶改造與表達優(yōu)化為酶法催化合成肝素奠定了基礎(chǔ)。

肝素，葡萄糖醛酸-C5-異構(gòu)化酶，異源表達，理性設(shè)計，底物結(jié)合口袋

肝素是一種存在于細胞表面和胞外基質(zhì)中的糖胺聚糖[1]，由己糖醛酸和葡糖胺組成的二糖單位重復連接而成[2]，在機體內(nèi)作為細胞識別、信號傳導和抗凝血等的生物學活性分子[3]。臨床上主要用于治療血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手術(shù)和術(shù)后抗凝血等。目前，肝素的生產(chǎn)方式主要包括生物提取[4]、化學合成[5]、酶法合 成[6]等。其中生物提取法獲得的肝素中混有多種糖胺聚糖，對產(chǎn)物造成污染；化學合成法生產(chǎn)周期長，過程繁瑣[7]；而酶法合成產(chǎn)物單一，過程簡單[8]。

在酶法合成肝素過程中，肝素前體先經(jīng)過脫乙酰和硫酸化作用轉(zhuǎn)變?yōu)镹-硫酸化肝素前體[9]，N-硫酸化肝素前體經(jīng)肝素C5異構(gòu)酶催化[10-12]，其多糖鏈上的D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid，D-GlcA) 異構(gòu)化為L-艾杜糖醛酸(L-iduronic acid，L-IdoA)，其中葡萄糖醛酸C5位的氫與介質(zhì)中的質(zhì)子發(fā)生交換[13]，C5位的羧基翻轉(zhuǎn)，導致分子構(gòu)型發(fā)生變化[14]。含有艾杜糖醛酸的多糖鏈進一步通過后續(xù)不同硫酸化位點的修飾合成具有生物學功能的肝素[15]。C5異構(gòu)化作用是肝素酶法合成過程中的一步關(guān)鍵反應(yīng)[16]，含有IdoA的GAGs (糖胺聚糖鏈) 才具有抗凝血和抗血脂等的功能[17]，因此C5異構(gòu)化作用是后續(xù)硫酸化修飾的前提。

隨著藥理學及臨床醫(yī)學的進展，肝素的應(yīng)用不斷擴大。但在體外酶法合成肝素[18]的過程中，途徑所涉及的關(guān)鍵性異構(gòu)酶酶活卻很低[19-21]，這嚴重限制了肝素的工業(yè)化生產(chǎn)，提高C5異構(gòu)酶的催化活性對于肝素的合成及其臨床應(yīng)用具有重大意義。本研究通過優(yōu)化表達載體、N端融合促溶標簽以及理性改造酶結(jié)構(gòu)等策略，獲得一株催化活性顯著提高的突變體V153R，其酶活與比酶活分別為 (5 804.32±5.63) U/L和 (145.14±2.33) U/mg，是野生型C5異構(gòu)酶酶活的2.41倍、比酶活的2.28倍。C5異構(gòu)酶的高活性表達為肝素的全酶法合成奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 宿主和質(zhì)粒

本實驗所有的質(zhì)粒構(gòu)建均在大腸桿菌JM109中進行，重組菌株構(gòu)建的出發(fā)菌株為BL21(DE3)。菌株JM109、BL21(DE3)，質(zhì)粒pET-28a (+)、pET-20b (+)、pCold Ⅲ均為本實驗室保存。詳情見表1。

1.2 菌株構(gòu)建

將密碼子優(yōu)化后的斑馬魚來源的基因(NP_998014.1) 經(jīng)PCR擴增(所用引物見表2) 后酶切連接至pCold Ⅲ、pET20b、pET28a，構(gòu)建重組載體pCold Ⅲ-C5、pET20b-C5、pET28a-C5。將來源于大腸桿菌的麥芽糖蛋白(Maltose binding protein，MBP)、釀酒酵母的促溶標簽SET2 (Solubility-enhancement tags) 及小泛素樣蛋白(Small ubiquitin-related modifier，SUMO) 基因經(jīng)PCR擴增(所用引物見表2) 后一步克隆連接至pCold Ⅲ-C5構(gòu)建重組載體pCold Ⅲ-MBP-C5、pCold Ⅲ-SET2-C5、pCold Ⅲ-SUMO-C5。42 ℃熱激90 s后，轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細胞中，挑取轉(zhuǎn)化子測序，測序正確則上述重組載體構(gòu)建成功。按上述方法將測序成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3) 感受態(tài)細胞。

表2 本文所用引物

Underlines represent the restriction site.

1.3 突變位點的預(yù)測

本實驗基于上述表達優(yōu)化的基礎(chǔ)，進一步對C5異構(gòu)酶酶分子結(jié)構(gòu)[22]理性改造提高C5異構(gòu)酶的催化活性。根據(jù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(Protein data bank，PDB) 下載的斑馬魚來源的蛋白結(jié)構(gòu)(PDB: 4pxq)，利用軟件Discovery Studio的CDOCKER模塊進行分子對接，具體操作方法和參數(shù)設(shè)置根據(jù)Discovery Studio軟件的操作手冊所述。

1.4 培養(yǎng)基組分

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L (固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂粉)。

TB培養(yǎng)基：酵母粉24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，K2HPO412.54 g/L，KH2PO42.31 g/L。

1.5 重組菌株培養(yǎng)

挑取單菌落接種于50 mg/L卡那霉素或者100 mg/L的氨芐霉素的3 mL液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。按1% (/) 將種子液接種于50 mL TB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至600為0.6–0.8，添加終濃度為0.05 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D- thiogalactoside，IPTG)，分別以30 ℃誘導培養(yǎng)pET系列重組菌株10 h、以15 ℃誘導培養(yǎng)pCold系列載體22 h，誘導異構(gòu)酶的表達。

1.6 粗酶液的制備

將上述發(fā)酵結(jié)束后的菌液于4 ℃、7 000 r/min條件下離心10 min，棄上清收集菌體，用20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4) 洗滌2次，稀釋菌體至600為8.0，冰水浴超聲破碎后(功率300 W，工作4 s，間歇6 s，10 min)，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，分別收集上清和沉淀。上清液即為所需粗酶液。

1.7 目的蛋白的純化

用25 mL溶液A (20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4) 平衡Ni-His Trap FF柱后上樣已過0.22 μm濾膜的粗酶液，分別用10%、30%、100%的溶液B (20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L咪唑，pH 7.4) 進行洗脫并收集相對應(yīng)的洗脫液。對得到的洗脫液進行脫鹽處理，所用脫鹽緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)，脫鹽柱為G10。經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS) 鑒定所得條帶為目的異構(gòu)酶條帶。

1.8 酶活性的檢測

C5異構(gòu)酶酶活測定：采用與肝素硫酸轉(zhuǎn)移酶2-OST (2-O-硫酸轉(zhuǎn)移酶，2-O-sulfotransferase) 偶聯(lián)[23-26]測酶活方法。標準反應(yīng)條件為向1.5 mL的Tris-HCl (20 mmol/L，pH 7.4) 中添加50 mmol/L PNPS (對硝基苯硫酸鹽，para-nitrophenylsulfate)，0.5 mmol/L PAP (3-磷酸腺苷-5-磷酰，3′-phosphoadenosine-5′-phospho)，0.5 mg AST Ⅳ(芳香磺基轉(zhuǎn)移酶，aryl sulfotransferase Ⅳ)，0.4 mg N-sulfoheparosan，0.3 mg硫酸轉(zhuǎn)移酶2-OST， 0.3 mg C5異構(gòu)酶(對照組為基于上述條件下添加等量失活的C5異構(gòu)酶酶液) 于37 ℃反應(yīng)2 h后，100 ℃水浴煮沸5 min終止反應(yīng)。10 000 r/min離心10 min去除沉淀，在400的吸光度測定對硝基苯酚(PNP) 的吸光值變化[27]。酶活單位定義為：在最適反應(yīng)條件下(37 ℃，pH 7.4)，每小時生成1 μmol/L的PNP所需的酶量。

1.9 動力學常數(shù)測定

C5異構(gòu)酶的動力學常數(shù)測定反應(yīng)液為1.5 mL Tris-HCl (20 mmol/L，pH 7.4)，其中包括50 mmol/L PNPS，0.5 mmol/L PAP，0.5 mg AST IV，0.3 mg 2-OST，0.3 mg C5及1.6–4 700 mg/L等不同濃度的N-sulfoheparosan作為底物測定C5異構(gòu)酶的酶活，根據(jù)測定值進行米氏常數(shù)擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同載體對C5異構(gòu)酶表達的影響

將C5異構(gòu)酶基因分別構(gòu)建在pET20b (+)、pET28a (+) 和pCold Ⅲ 3種表達載體中，考察不同載體對C5異構(gòu)酶表達差異性的影響。在液體培養(yǎng)基中接種重組菌pET20b-C5、pET28a-C5、pCold Ⅲ-C5及空載體作為對照菌，當600達到0.6時，加入IPTG誘導表達，收集pET系列10 h后的菌體及pCold系列22 h后的菌體，破碎細胞后利用SDS-PAGE分析胞內(nèi)上清及沉淀。如圖1A所示，C5異構(gòu)酶在3種載體中均實現(xiàn)成功表達，其中pCold Ⅲ載體的上清可溶部分表達量最高，酶活最高為 (1 873.61±5.42) U/L。這可能是因為在低溫條件下(15 ℃)，嗜冷型啟動子的轉(zhuǎn)錄強度高于T7啟動子[28]，且低溫使得合成的C5異構(gòu)酶可以正確折疊，可溶表達部分增加。

圖1 不同載體對C5異構(gòu)酶表達的影響

2.2 不同融合標簽對C5異構(gòu)酶表達的影響

以上3種載體均實現(xiàn)了C5異構(gòu)酶的活性表達，其中以pCold Ⅲ載體表達的C5異構(gòu)酶胞內(nèi)可溶表達量最高。在此基礎(chǔ)上，進一步研究了N端融合促溶標簽MBP、SUMO、SET2對C5異構(gòu)酶活性表達的影響。如圖2所示，在N端融合SET2后C5異構(gòu)酶可溶性表達量最高，酶活也最高，達到 (2 409.25±6.43) U/L，是融合前的1.28倍。結(jié)果表明促溶標簽SET2可有效地促進異構(gòu)酶的可溶表達[29]。

2.3 定點突變提高C5異構(gòu)酶催化活性

根據(jù)已報道的酶晶體結(jié)構(gòu)分析，經(jīng)分子對接，選擇距離底物結(jié)合口袋5 ?范圍內(nèi)的氨基酸位點，以pCold Ⅲ-SET2-C5為模板，對V153、D155、Q185、K397、G399、N478、D529、D545進行飽和突變。獲得催化活性顯著提高的突變體V153R，胞內(nèi)上清酶液純化后比酶活達到 (145.14±2.33) U/mg。反應(yīng)動力學常數(shù)顯示其m值由原來的(1.922±0.131) mmol/L降低至 (0.941±0.083) mmol/L，催化常數(shù)cat/m由(16.129±0.111) 增加至(44.633±0.547) L/(s·mol)；突變體G399Em值降低至 (1.525±0.273) mmol/L，催化常數(shù)cat/m增加至 (22.951±0.146) L/(s·mol)、D545Ym值降低至 (1.366±0.196) mmol/L，催化常數(shù)cat/m增加至 (27.086±0.102) L/(s·mol)，說明突變體與底物的親和力增加。原因可能是由于底物帶有較強的負電荷，當153位氨基酸由側(cè)鏈不帶電荷的纈氨酸變?yōu)閹в姓姾傻木彼釙r，異構(gòu)酶底物結(jié)合口袋局部環(huán)境中的正電荷強度增加(如圖4A、4B所示)，且突變后(圖4B) 相比突變前(圖4A)，側(cè)鏈更長，距離底物更近，底物更容易進入結(jié)合口袋；399位氨基酸突變前后如圖4C、4D所示，突變前399位甘氨酸(圖4C) 與底物只有一個氫鍵作用力，突變?yōu)楣劝彼?圖4D) 后相比突變前氫鍵作用力增加，但同時底物結(jié)合口袋負電荷強度也增加；545位氨基酸突變前后如圖4E、4F所示，突變前545位天冬氨酸(圖4E) 與底物沒有作用，突變?yōu)槔野彼岷?圖4F) 與底物增加了疏水作用力，同時突變后底物結(jié)合口袋局部負電荷強度變?nèi)?，因此以?個氨基酸位點可能發(fā)生多重作用力的疊加，導致催化活性呈現(xiàn)不同程度的提高?；谝陨辖Y(jié)果對153R、399E、545Y 3個單點突變體進行了兩兩疊加突變，并未發(fā)現(xiàn)明顯效果(數(shù)據(jù)未展示)。

圖2 不同促溶標簽對C5異構(gòu)酶表達的影響

圖3 肝素C5異構(gòu)酶純化及突變體酶活

表3 肝素異構(gòu)酶酶學性質(zhì)表

圖4 肝素C5異構(gòu)酶突變體結(jié)構(gòu)分析

3 結(jié)論

C5異構(gòu)酶作為肝素酶法合成中的一個關(guān)鍵酶，催化葡萄糖醛酸異構(gòu)化為艾杜糖醛酸。本研究通過表達載體優(yōu)化、N端融合標簽及蛋白質(zhì)理性改造成功地在大腸桿菌中實現(xiàn)了斑馬魚來源的肝素C5異構(gòu)酶的活性表達。研究表明3種載體pET28a、pET20b、pCold Ⅲ均實現(xiàn)了C5異構(gòu)酶的胞內(nèi)活性表達，相比嗜冷啟動型載體pCold Ⅲ表達的C5異構(gòu)酶活性最高。通過N端融合促溶標簽SET2減少了無活性的包涵體的積累，進一步提高了C5異構(gòu)酶的活性表達((2 409.25±6.43) U/L)。在此基礎(chǔ)上，為了獲得更高催化活性的C5異構(gòu)酶，我們對C5異構(gòu)酶的分子結(jié)構(gòu)進行了理性改造，獲得了突變體V153R，其酶活與比酶活分別為 (5 804.32±5.63) U/L和 (145.14±2.33) U/mg，是野生型C5異構(gòu)酶的2.41倍和2.28倍。該研究為實現(xiàn)肝素的全酶法合成奠定了基礎(chǔ)。

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Expression optimization and molecular modification of heparin C5 epimerase

Bingbing Wang1,2, Zhengxiong Zhou1,2, Xuerong Jin1,2, Jianghua Li1,2, Zhongping Shi1,2, and Zhen Kang1,2

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education,School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Heparin and heparan sulfate are a class of glycosaminoglycans for clinical anticoagulation. Heparosan N-sulfate-glucuronate 5-epimerase (C5, EC 5.1.3.17) is a critical modifying enzyme in the synthesis of heparin and heparan sulfate, and catalyzes the inversion of carboxyl group at position 5 on D-glucuronic acid (D-GlcA) of N-sulfoheparosan to form L-iduronic acid (L-IdoA). In this study, the heparin C5 epimerase genefrom zebrafish was expressed and molecularly modified in. After comparing three expression vectors of pET-20b (+), pET-28a (+) and pCold Ⅲ, C5 activity reached the highest ((1 873.61±5.42) U/L) with the vector pCold Ⅲ. Then we fused the solution-promoting label SET2 at the N-terminal for increasing the soluble expression of C5. As a result, the soluble protein expression was increased by 50% compared with the control, and the enzyme activity reached (2 409±6.43) U/L. Based on this, site-directed mutations near the substrate binding pocket were performed through rational design, the optimal mutant (V153R) enzyme activity and specific enzyme activity were (5 804±5.63) U/L and (145.1±2.33) U/mg, respectively 2.41-fold and 2.28-fold of the original enzyme. Modification and expression optimization of heparin C5 epimerase has laid the foundation for heparin enzymatic catalytic biosynthesis.

heparin, glucuronic acid-C5-epimerase, heterologous expression, rational design, substrate binding pocket

10.13345/j.cjb.190516

November 18, 2019;

January 21, 2020

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31670092), National Key R&D Program of China (No. 2018YFA0901401), Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. JUSRP51707A), National First-class Discipline Program of Light Industry Technology and Engineering (No. LITE2018-16).

Zhen Kang. Tel: +86-510-85918307; Fax: +86-510-85918309; E-mail: zkang@jiangnan.edu.cn

Zhongping Shi. Tel: +86-510-85329031; Fax: +86-510-85918309; E-mail: zpshi@jiangnan.edu.cn

國家自然科學基金(No. 31670092)，國家重點研發(fā)計劃 (No. 2018YFA0901401)，江南大學自主科研計劃重點項目(No. JUSRP51707A)，國家輕工技術(shù)與工程一流學科自主課題(No. LITE2018-16) 資助。

2020-05-08

https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20200508.1434.004.html

王兵兵, 周正雄, 金學榮, 等. 肝素C5異構(gòu)酶的表達優(yōu)化及分子改造. 生物工程學報, 2020, 36(7): 1450–1458.

Wang BB, Zhou ZX, Jin XR, et al. Expression optimization and molecular modification of heparin C5 epimerase. Chin J Biotech, 2020, 36(7): 1450–1458.

(本文責編 郝麗芳)