吳思穎，康 梅，劉 雅，肖玉玲，何 超，謝 軼，馬 瑩

(四川大學華西醫(yī)院實驗醫(yī)學科，四川成都 610041)

隱球菌腦膜炎是由隱球菌引起的中樞神經系統(tǒng)感染，主要累及免疫功能受損人群，如人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者和器官移植患者，也可引起免疫功能正常者的感染。中樞神經系統(tǒng)隱球菌病預后較差，病死率高，即使經過標準的抗真菌治療，病死率仍可高達60%[1]。因此早期診斷和治療尤為重要。常見的致病隱球菌主要包括新生隱球菌和格特隱球菌，主要包括8種基因型：新生隱球菌基因型VNⅠ～Ⅳ，格特隱球菌基因型VGⅠ～Ⅳ[2]。隱球菌的傳統(tǒng)鑒定方法主要依靠生化試驗，但是該方法耗時長，缺乏及時性。分子生物學鑒定和分型方法成本較高且操作復雜，不適用于實驗室常規(guī)檢測?；|輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)是分析非揮發(fā)性生物大分子的一種新型軟電離質譜技術，可用于病原微生物的鑒定[3]。由于其具有快速、靈敏、準確、高通量及自動化等特點，MALDI-TOF MS已成為微生物鑒定領域非常重要的技術工具和手段。本研究應用MALDI-TOF MS對常見的致病隱球菌進行快速鑒定并進一步對隱球菌不同基因型進行聚類分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年6月至2019年11月本院各科室分離的44株隱球菌臨床株。

1.2儀器與試劑 MALDI-TOF MS(Bruker Daltonik GmbH，德國)，API 20C(bioMérieux，法國)，PCR擴增儀(ABI，美國)，限制性內切酶Sau96Ⅰ、HhaⅠ(New England Biolabs，美國)，Gel Doc XR 凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國)。沙氏瓊脂平板(鄭州安圖)，α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA，Bruker Daltonik GmbH，德國)，無水乙醇(成都科龍)，三氟乙酸(MERCK公司，德國)，乙腈(Tedia公司，美國)，甲酸(Anaqua Chemicals Supply，美國)。

1.3方法

1.3.1隱球菌基因分型 利用URA5基因PCR產物限制性片段長度多態(tài)性(URA5-RFLP)方法對44株隱球菌臨床株進行基因分型。PCR擴增引物：URA5(5′-ATG TCC TCC CAA GCC CTC GAC TCC G-3′)，SJ01(5′-TTA AGA CCT CTG AAC ACC GTA CTC-3′)。PCR擴增條件：94 ℃預變性2 min,94 ℃變性45 s,61 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,35個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。使用Sau96Ⅰ(10 U/μL)和HhaⅠ(20 U/μL)這兩種限制性內切酶對上述PCR產物進行雙酶切。將酶切體系于37 ℃水浴3 h,得到酶切產物。將臨床株和標準菌株的酶切產物10 μL于2%的瓊脂糖凝膠中100 V電泳2.5 h, 以DL2000作為分子量標記物，在Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結果，比較隱球菌臨床株與8株不同基因型標準菌株的酶切譜型，得出隱球菌臨床株的基因型。隱球菌基因分型標準菌株如下：WM148(VNⅠ),WM626(VNⅡ),WM628(VNⅢ),WM629(VNⅣ),WM179(VGⅠ),WM178(VGⅡ),WM161(VGⅢ)和WM779(VGⅣ)。

1.3.2MALDI-TOF MS鑒定 MALDI-TOF MS系統(tǒng)采用線性正性模式，采集相對分子質量為(2～20)×103的圖譜。采用甲酸提取法，取待測菌株，加入300 μL水、900 μL乙醇，混勻，加入30 μL 70%甲酸溶液，混勻后再加入30 μL乙腈混勻，離心取1 μL上清液在MALDI靶板上點樣，晾干后添加1 μL HCCA，晾干。每個樣本置于靶板上的6個不同位點，即每個樣本生成6個合成的圖譜(MSP)。將待鑒定隱球菌的質譜數據與數據庫中參考菌株的數據進行比對，根據匹配程度得到相應分值，最終得到鑒定結果。得分≥2.0表示鑒定到種水平，1.7～<2.0表示鑒定到屬水平，<1.7表示不可信的鑒定結果。

1.3.3聚類分析 使用MALDI Biotype軟件對44株隱球菌臨床株和8株基因分型標準菌株進行聚類分析，構建MSP聚類分析樹狀圖。

2 結 果

2.1隱球菌基因分型結果 44株隱球菌臨床株URA5-RFLP分型結果顯示，42株為新生隱球菌VNⅠ型，1株為格特隱球菌VGⅠ型，1株為格特隱球菌VGⅡ型。隱球菌基因分型結果見圖1。

注：A和B為隱球菌基因分型標準菌株和部分臨床株酶切產物電泳圖；圖A中10為格特隱球菌VGⅠ型(臨床株)，9為新生隱球菌VNⅠ型(臨床株)；圖B中10為格特隱球菌VGⅡ型(臨床株)，9為新生隱球菌VNⅠ型(臨床株)；M為標記物；1～4分別為新生隱球菌基因型標準菌株WM148(VNⅠ)、WM626(VNⅡ)、WM628(VNⅢ)、WM629(VNⅣ)；5～8分別為格特隱球菌基因型標準菌株WM179(VGⅠ)、WM178(VGⅡ)、WM161(VGⅢ)、WM779(VGⅣ)。圖1 隱球菌基因分型標準菌株和部分臨床株URA5-RFLP分型結果

2.2MALDI-TOF MS鑒定結果 MALDI-TOF MS對隱球菌標準菌株和臨床株的鑒定結果與分子生物學鑒定結果完全一致。42株隱球菌臨床株鑒定為新生隱球菌，另外2株鑒定為格特隱球菌，鑒定結果得分為1.975～2.346分。標準菌株的鑒定得分如下，WM148:2.109分；WM626:2.059分；WM628:2.134分；WM629:2.045分；WM179:2.041分；WM178:2.210分；WM161:2.051分；WM779:1.969。

2.3新生隱球菌和格特隱球菌以及不同基因型之間質譜圖的特點 新生隱球菌和格特隱球菌之間，以及新生隱球菌和格特隱球菌不同基因型之間，特征蛋白的質量和峰的信號強度存在差異。新生隱球菌VNⅡ型標準菌株WM626在8 000～1 000 m/z有2個明顯的質譜峰，而新生隱球菌其他基因型卻不明顯。格特隱球菌VGⅠ型標準菌株WM179在5 000～6 000 m/z有1個明顯的質譜峰。所有新生隱球菌臨床株的質譜圖與VNⅠ型標準菌株WM148更接近。格特隱球菌VGⅠ型臨床株(F14)的質譜圖與VGⅠ型標準菌株WM179更相似。格特隱球菌VGⅡ型臨床株(F44)的質譜圖與VGⅡ型標準菌株WM178更接近。

2.4聚類分析 對所有隱球菌臨床株和基因分型標準菌株進行聚類分析，得到MSP聚類分析樹狀圖。從圖中可以看到，新生隱球菌和格特隱球菌分別位于兩個不同的集群，且新生隱球菌和格特隱球菌不同基因型被區(qū)分開。絕大多數新生隱球菌VNⅠ型臨床株與VNⅠ型標準菌株WM148位于同一集群，格特隱球菌VGⅠ型和VGⅡ型臨床株分別與VGⅠ型標準菌株WM179和VGⅡ型標準菌株WM178位于同一集群。見圖2。

圖2 44株隱球菌臨床株和8株基因分型標準菌株MSP聚類分析樹狀圖

3 討 論

臨床實驗室中隱球菌的傳統(tǒng)鑒定方法主要依靠生化試驗和形態(tài)學檢查，但均不能區(qū)分新生隱球菌和格特隱球菌，而兩者所致感染在臨床表現、體外藥敏試驗和治療預后等方面均存在明顯差異[4]。分子生物學分型方法如限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)和多位點或全基因組序列分析等，由于價格昂貴，操作較煩瑣，往往局限在參考實驗室，目前未在臨床常規(guī)使用[5]。MALDI-TOF MS具有經濟、操作簡單的特點，可快速為臨床提供檢測結果，使患者得到即時的治療。本研究應用MALDI-TOF MS對隱球菌臨床株和標準菌株進行快速鑒定，結果顯示44株隱球菌臨床株和8株基因分型標準菌株的鑒定結果與分子生物學鑒定結果一致，可準確區(qū)分新生隱球菌和格特隱球菌。劉濤華等[6]對20株隱球菌的研究發(fā)現，MALDI-TOF MS可作為隱球菌屬分類鑒別中有效的輔助手段，相比于多位點序列分析技術，MALDI-TOF MS更為快捷。ZHANG等[7]研究發(fā)現，MALDI-TOF MS對新生隱球菌的鑒定具有100%的準確性，但唯一1株格特隱球菌被錯誤鑒定為新生隱球菌。由于國內的隱球菌感染主要以新生隱球菌為主，格特隱球菌屬于散發(fā)病例，因此還需收集更多的格特隱球菌以評價MALDI-TOF MS對格特隱球菌的鑒定能力。黃聲雷等[8]對兩種MALDI-TOF MS系統(tǒng)進行了評價，對于常見的非白色念珠菌，Autoflex MALDI-TOF MS系統(tǒng)鑒定準確性優(yōu)于Vitek MALDI-TOF MS系統(tǒng)。對于隱球菌的鑒定，Autoflex MALDI-TOF MS系統(tǒng)是否優(yōu)于Vitek MALDI-TOF MS系統(tǒng)，尚需進一步研究。

MALDI-TOF MS不僅能用于病原微生物的鑒定，而且還具有分型能力，可進一步應用于病原微生物的分型。例如MALDI-TOF MS應用于弗勞地枸櫞酸桿菌和黏質沙雷菌的分型，其結果與全基因組序列分析具有較好的一致性[9]?；贛ALDI-TOF MS的聚類分析可對哈維弧菌進行溯源性分析[10]。MALDI-TOF MS也可用于真菌的分型。CHAO等[11]利用MALDI-TOF MS聚類分析可區(qū)分皺褶假絲酵母菌復合體中的發(fā)酵假絲酵母菌和季也蒙假絲酵母菌。FIRACATIVE等[12]研究發(fā)現，新生隱球菌和格特隱球菌不同基因型之間的質譜峰圖存在差異，聚類分析發(fā)現新生隱球菌與格特隱球菌不同基因型分別位于不同的集群，相同基因型則位于同一集群。POSTERARO等[13]運用MALDI-TOF MS對82株隱球菌(72株新生隱球菌、10株格特隱球菌)進行聚類分析，其中81株(98.8%)被準確歸于相應的基因型，僅1株VGⅡ型格特隱球菌被錯誤地歸于VGⅠ集群。SIQUEIRA等[14]納入隱球菌不同基因型建立數據庫，進一步評估該數據庫用于區(qū)分新生隱球菌和格特隱球菌不同基因型的能力，結果顯示該數據庫可對所有新生隱球菌和格特隱球菌基因型進行正確鑒定。本研究中隱球菌臨床株和不同基因型的標準菌株聚類分析發(fā)現，絕大多數VNⅠ型臨床株與VNⅠ型標準菌株位于同一集群，僅少數VNⅠ型臨床株位于另一集群。推測基于MALDI-TOF MS的聚類分析可能會受到樣品蛋白制備以及菌株蛋白表達量的影響。在進行分型或亞種水平鑒定時，需要識別更多的具有重現性的質譜峰，需要設置更多的平行組。此外，對未知病原菌的分型鑒定必須要有足夠多的已知菌株的數據庫，方可實現最佳匹配，提高其鑒定分型能力[15]。本研究中44株經過分子生物學確認基因型的隱球菌已經全部納入數據庫中。由于本研究中所有新生隱球菌臨床株均為VNⅠ型，且只有2株格特隱球菌，應該納入更多隱球菌基因型以評價MALDI-TOF MS對隱球菌的分型能力。

4 結 論

綜上所述，MALDI-TOF MS作為一種快速的鑒定方法可以準確區(qū)分新生隱球菌和格特隱球菌，且可作為一種潛在的分型方法對新生隱球菌和格特隱球菌不同基因型進行區(qū)分。