張琳琳，劉 剛,2，方 俊

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所， 湖南 長(zhǎng)沙 410125）

近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，水體中毒性物質(zhì)的豐度和廣度不斷增加，因此對(duì)水體質(zhì)量的監(jiān)測(cè)成為社會(huì)各界廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。發(fā)光細(xì)菌法的生物急性毒性檢測(cè)是以發(fā)光細(xì)菌為生物受試體，與樣品接觸反應(yīng)一定時(shí)間后，通過生物毒性傳感器來讀取樣品發(fā)光強(qiáng)度變化與無毒性空白對(duì)照比值的一種快速、重復(fù)性高、誤差小的生物急性檢測(cè)方法[2]，已在多個(gè)國(guó)家的毒性檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用[3]。由于其獨(dú)特的生理特性，發(fā)光細(xì)菌在快速檢測(cè)水體毒理成分時(shí)具備檢測(cè)周期短、靈敏度高、檢測(cè)方式便捷、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)[4]。 對(duì)于發(fā)光細(xì)菌種類的選擇，國(guó)內(nèi)常用的有明亮發(fā)光桿菌、青?；【唾M(fèi)氏弧菌，美國(guó)環(huán)保署推薦的是費(fèi)氏弧菌[5-6]。這類細(xì)菌在正常生理環(huán)境下的新陳代謝會(huì)產(chǎn)生熒光物質(zhì)，而當(dāng)水體中有毒物質(zhì)含量升高時(shí)，發(fā)光細(xì)菌的呼吸作用就會(huì)受到抑制，因此所產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度會(huì)變?nèi)酢ａ槍?duì)這一特性，便攜發(fā)光細(xì)菌毒性儀只需要檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，就可以對(duì)水體毒性做出判斷[7-9]。該研究采用同時(shí)滿足國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)的費(fèi)氏弧菌對(duì)市面上最常用的2 種便攜式生物毒性檢測(cè)儀器進(jìn)行性能測(cè)試，以期為毒理檢測(cè)的儀器選擇提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 水樣采集

從長(zhǎng)沙縣松雅湖采集湖庫(kù)水，從撈刀河鎮(zhèn)茶子山村采集地下井水和養(yǎng)殖污水，從長(zhǎng)沙恒昌化工廠采集化工廢水。不同水樣均于2020 年1 月5 日現(xiàn)場(chǎng)采集，用pH 試紙測(cè)量水樣pH 值，確保其在6.0～8.5 范圍內(nèi)，若不在該范圍內(nèi)，用稀鹽酸溶液或稀氫氧化鈉溶液中和水樣pH 值至7.0±0.2。

1.2 供試設(shè)備與試劑

供試生物毒性測(cè)定儀分2 種型號(hào)，一種為國(guó)產(chǎn)Lux-T020 型，一種為美國(guó)DeltaTox Ⅱ型；其他設(shè)備還有2 mL 玻璃檢測(cè)池、美國(guó)熱電移液器（200 μL、1 mL）。主要試劑有費(fèi)氏弧菌凍干粉（實(shí)驗(yàn)室自產(chǎn)），氯化鈉、七水硫酸鋅、鹽酸、氫氧化鈉（國(guó)藥分析純）和純凈水。

1.3 測(cè)試方法與步驟

采用GB/T15441—1995[10]中的方法進(jìn)行分析測(cè)定。（1）打開測(cè)試儀器，預(yù)熱10 min，在黑暗條件下，測(cè)試36 次未加樣品的本底讀值，檢測(cè)儀器背景信號(hào)的穩(wěn)定性。（2）取2 mL 含3%氯化鈉的參比水，分別加入20～280 μL（以20 μL 為一個(gè)等級(jí)，共設(shè)計(jì)14個(gè)梯度）的費(fèi)氏弧菌菌懸液，2 臺(tái)儀器同時(shí)檢測(cè)，比較光電倍增管的曲線變化。（3）取2 mL 含3%氯化鈉的樣品，加入25 μL 費(fèi)氏弧菌菌懸液（取1 支在-20℃保存的費(fèi)氏弧菌凍干粉，加入40 mL 復(fù)蘇液水合溶解，置于4℃冰箱中，供待測(cè)樣品使用），菌液與樣品的接觸反應(yīng)時(shí)間為15 min。水樣、陰性質(zhì)控（純凈水）和陽性質(zhì)控（2 mg/L 的七水硫酸鋅）均平行測(cè)定6 次，以相對(duì)抑制率來表示毒性大小。

相對(duì)抑制率（%）=1-相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度（%）

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器的穩(wěn)定性

從表1 可以看出，國(guó)產(chǎn)Lux-T020 型儀器的暗計(jì)數(shù)讀值在25～84 S-1之間波動(dòng)，滿足出廠≤200 S-1的要求；而美國(guó)DeltaTox Ⅱ型儀器的暗計(jì)數(shù)讀值在4～12 S-1之間波動(dòng)，滿足出廠≤100 S-1的要求。

2.2 2 種生物毒性測(cè)定儀光電倍增管的變化曲線

從圖1 可以看出，美國(guó)DeltaTox Ⅱ型儀器在491043 3～358262 96 S-1之間有較好的線性，國(guó)產(chǎn)Lux-T020 型儀器在266 768 4～195 675 43 S-1之間有較好的線性，2 臺(tái)儀器所用檢測(cè)器（光電倍增管）的線性范圍存在著明顯的差異。從圖1 中還可以看出，美國(guó)DeltaTox Ⅱ型儀器在第8 個(gè)點(diǎn)（即添加160 μL 費(fèi)氏弧菌菌懸液）時(shí)，光子量已達(dá)到飽和，國(guó)產(chǎn)Lux-T020 型儀器的光子量在第10 個(gè)點(diǎn)（即添加200 μL 費(fèi)氏弧菌菌懸液）時(shí)達(dá)到飽和。

表1 2 臺(tái)儀器的暗計(jì)數(shù)讀值 （S-1）

圖1 2 種生物毒性測(cè)定儀光電倍增管的變化曲線

2.3 陰性、陽性質(zhì)控試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，采用純凈水做參比時(shí)，2 臺(tái)儀器測(cè)試得到的相對(duì)抑制率在-2.46%～2.94%范圍內(nèi)，均滿足儀器設(shè)計(jì)參數(shù)±5%的要求；當(dāng)以2 mg/L 七水硫酸鋅作陽性質(zhì)控液、以純凈水做參比時(shí)，國(guó)產(chǎn)Lux-T020型儀器的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.00，美國(guó)DeltaTox Ⅱ型儀器的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.67，但美國(guó)DeltaTox Ⅱ型儀器獲得的相對(duì)抑制率比國(guó)產(chǎn)Lux-T020 型儀器獲得的平均偏高20.28 個(gè)百分點(diǎn)。

2.4 4 種水樣測(cè)試結(jié)果

由表3 可知，測(cè)試清潔的湖庫(kù)水，國(guó)產(chǎn)Lux-T020型儀器的測(cè)試極差為14.3，美國(guó)DeltaTox Ⅱ型儀器的測(cè)試極差為12.6；測(cè)試未受污染的地下井水，國(guó)產(chǎn)Lux-T020 型儀器的測(cè)試極差為11.5，DeltaTox Ⅱ型儀器的測(cè)試極差為4.7；測(cè)試養(yǎng)殖污水，國(guó)產(chǎn)Lux-T020型儀器的標(biāo)準(zhǔn)偏差1.13，美國(guó)DeltaTox Ⅱ型儀器的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.59；測(cè)試有毒化工廢水，國(guó)產(chǎn)Lux-T020型儀器的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.30，美國(guó)DeltaTox Ⅱ型儀器的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.03。

表3 不同水樣的測(cè)試結(jié)果 （%）

中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所將水質(zhì)毒性分為5 個(gè)等級(jí)。由表4 可知，2 臺(tái)儀器在測(cè)試清潔的湖庫(kù)水與地下井水時(shí)，毒性級(jí)別均為低毒；但測(cè)試養(yǎng)殖污水時(shí)，國(guó)產(chǎn)Lux-T020 型儀器的毒性級(jí)別為中毒，而美國(guó)DeltaTox Ⅱ型儀器的毒性級(jí)別為重毒；2 臺(tái)儀器在測(cè)試化工廢水時(shí)，毒性級(jí)別均為高毒。

3 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用費(fèi)氏弧菌凍干粉，在相同的測(cè)試條件下，儀器的暗計(jì)數(shù)、陰性質(zhì)控均能達(dá)到指標(biāo)要求。測(cè)試較清潔的湖庫(kù)水和地下井水時(shí)，2 臺(tái)儀器的毒性分級(jí)同在低毒級(jí)別。通過光電倍增管的線性范圍比較得知，2 臺(tái)儀器所選光電倍增管的型號(hào)不同，是造成測(cè)試養(yǎng)殖污水時(shí)，水樣毒性分級(jí)不一致的主要原因。水樣測(cè)試的相對(duì)抑制率越高，水樣的毒性越強(qiáng)。目前國(guó)內(nèi)環(huán)境監(jiān)測(cè)部門使用的便攜式毒性儀有各種品牌，各品牌的生物毒性檢測(cè)模式、所用菌種、光電倍增管各有差異，均會(huì)造成測(cè)試現(xiàn)場(chǎng)水樣的數(shù)值和毒性分級(jí)不一致。