陳鳳強 劉正武 于大海 李 晶 王 潔

(1 南寧市第二人民醫(yī)院口腔科，廣西南寧市 530031；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科，廣西南寧市 530021；3 南寧市第二人民醫(yī)院科教部，廣西南寧市 530031)

近年來，由于環(huán)境、生活壓力、遺傳等多方面因素的影響，口腔頜面部腫瘤發(fā)病率有所增高，尤其以惡性腫瘤最為明顯。在全世界范圍內(nèi)，每年大約有65萬新增病例和35萬死亡病例為頭頸部惡性腫瘤患者，位居人類常見惡性腫瘤的第六位[1]。缺氧是癌癥發(fā)生的重要始動因素，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生新生血管的最重要因子。癌癥形成初期，癌細胞處于細胞增殖與凋亡的動態(tài)平衡中，腫瘤生長極其緩慢，但當(dāng)癌細胞周圍微環(huán)境發(fā)生改變，局部缺氧激活了缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-irducible factor-1α，HIF-1α), HIF-1α進而對促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)和VEGF的表達進行調(diào)控，促進機體EPO增加。VEGF表達上調(diào)，使腫瘤局部毛細血管和淋巴管通透性增加，刺激內(nèi)皮細胞移行增殖，誘導(dǎo)血管和淋巴管的生成，促進了癌細胞的迅速增殖[2-4]。臨床病理學(xué)證實，口腔癌患者的預(yù)后、生存率與腫瘤的血管和淋巴管生成計數(shù)呈負相關(guān)，同時HIF-1α的表達與血管、淋巴管生成計數(shù)呈正相關(guān)[5-7]。還有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在腫瘤細胞分化過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，HIF-1α的過度表達在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮重要作用[8]。本實驗對比分析HIF-1α在人與小鼠正?？谇火つど掀?、異常增生、高分化鱗癌及其轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達情況，進一步了解HIF-1α在口腔癌形成過程中的作用?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料 前期實驗[9]確立并制備好的BALB/c小鼠正?？谇火つど掀ぁ惓Ｔ錾?、高分化鱗癌原發(fā)灶及頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本各20份。人口腔癌旁正常組織標(biāo)本、口腔上皮異常增生標(biāo)本、口腔高分化鱗癌原發(fā)灶及其頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本各取20份，來源于2010年1月至2012年10月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院手術(shù)切除經(jīng)病理證實的口腔癌及口腔黏膜異常增生患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受放療、化療、生物治療及任何其他治療；口腔上皮異常增生或口腔鱗癌經(jīng)2名病理醫(yī)師確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：接受過放化治療者；非原發(fā)于口腔的轉(zhuǎn)移癌者；口腔癌復(fù)發(fā)的患者?；颊吣挲g28～78歲，平均年齡53歲。將選取的標(biāo)本迅速放入10%甲醛溶液中，常規(guī)行石蠟包埋和切片，做HE染色及免疫組化染色。

1.2 試劑 兔抗人HIF-1α多克隆抗體購自武漢博士得生物有限公司；羊抗鼠抗兔通用型二抗購自上海長島公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)0.01 mol/L，pH值7.2～7.4，購自福州邁新生物技術(shù)有限公司；EDTA緩沖液購自福州邁新生物技術(shù)有限公司；DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物工程有限公司；3%H2O2購自北京中杉金橋生物工程有限公司；二甲苯購自上海振華化工廠；防脫玻片購自福州邁新新生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 采用免疫組織二步法常規(guī)操作。小鼠頜下淋巴結(jié)石蠟切片置于67 ℃烘箱中，烘片2 h，脫蠟至水，用0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次3 min，胰蛋白酶修復(fù)抗原，3% H2O2室溫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，蒸餾水沖洗3次，滴一抗HIF-1α(按1 ∶100稀釋)，于4 ℃冰箱過夜。PBS沖洗3遍，每次3 min，滴二抗酶標(biāo)抗鼠聚合物，室溫下孵育30 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察并控制顯色時間，用HIF-1α抗體已知陽性組織做陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定 HIF-1α陽性顯色為棕黃色細顆粒，主要為胞漿著色，少量為核著色，按綜合染色強度和陽性細胞占總細胞數(shù)的百分比進行半定量處理。染色強度按下列標(biāo)準(zhǔn)評分：著色弱但明顯強于陰性對照者為1分，染色清晰者為2分，染色強者為3分；陽性細胞占總細胞數(shù)的10%～50%為2分，占51%～80%為3分，>80%為4分。上述兩項評分相加，不管其染色強度，只要陽性細胞數(shù)<10%為(-)；3分為弱陽性(+)；4～5分為中陽性(++)；6～7分為強陽性(+++)[10]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 運用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用例數(shù)和百分率[n(%)]表示,組間比較采用χ2檢驗、秩和檢驗或Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HIF-1α在正常口腔黏膜組織的表達情況 20份人及小鼠正?？谇火つど掀ぞ匆娂毎|(zhì)或細胞核有棕黃色著色，HIF-1α為陰性表達(圖1A、圖2A)，PBS陰性對照未見染色。

2.2 HIF-1α在口腔異常增生中的表達情況 20份人口腔黏膜異常增生標(biāo)本中有5份HIF-1α表達陽性(圖1B),其中4份為基底膜附近部分細胞胞漿及個別細胞胞核染色強于陰性對照，呈淡黃色著色，HIF-1α為弱陽性表達；1份為基底膜附近多個細胞胞漿或胞核呈現(xiàn)清晰的棕黃色著色，HIF-1α為中陽性表達。20份小鼠口腔黏膜異常增生標(biāo)本中有6份HIF-1α表達陽性(圖2B)，其中4份為基底膜附近部分細胞胞漿及個別細胞胞核染色強于陰性對照，呈淡黃色著色，HIF-1α為弱陽性表達；2份為基底膜附近多個細胞胞漿或胞核呈現(xiàn)清晰的棕黃色著色，HIF-1α為中陽性表達。

2.3 HIF-1α在口腔高分化鱗癌中的表達情況 20份人口腔高分化鱗癌標(biāo)本中HIF-1α全部表達陽性，陽性表達表現(xiàn)為癌巢區(qū)大部分細胞的胞漿呈現(xiàn)棕黃色著色(圖1C)；12份弱陽性表達，5份中陽性表達，3份強陽性表達。20份小鼠口腔黏膜癌標(biāo)本中HIF-1α有19份表達陽性，表現(xiàn)為癌巢區(qū)大部分細胞的胞漿呈現(xiàn)出棕黃色著色(圖2C)，其中13份為弱陽性表達，4份為中陽性表達，2份為強陽性表達，在多個癌巢的角化珠著色強，呈現(xiàn)明顯的棕黃色著色。

2.4 HIF-1α在口腔高分化鱗癌頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達情況 20份人口腔高分化鱗癌頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中有3份HIF-1α弱陽性表達，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移灶中部分細胞胞漿及個別胞核呈現(xiàn)淡黃色著色(圖1D)。20份小鼠口腔高分化鱗癌頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中有2份HIF-1α弱陽性表達，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移灶中大部分細胞的胞漿呈現(xiàn)淡黃色著色(圖2D)。

圖1 HIF-1α在人口腔正常上皮、異常增生、高分化鱗癌及其頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達情況

圖2 HIF-1α在小鼠口腔正常上皮、異常增生、高分化鱗癌及其頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達情況

2.5 HIF-1α在正常口腔黏膜、異常增生、高分化鱗癌及其頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶表達的比較 人和小鼠HIF-1α陽性表達率均呈由正?？谇火つど掀ぁ惓Ｔ錾娇谇桓叻只[癌的上升趨勢，但頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶表達較原發(fā)灶明顯降低。HIF-1α陽性表達率在正?？谇火つど掀づc口腔高分化鱗癌、異常增生與口腔高分化鱗癌、口腔高分化鱗癌與頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05), HIF-1α陽性表達率在正常口腔黏膜與異常增生、正?？谇火つづc頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、異常增生與頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 HIF-1α在人和小鼠口腔正常上皮、異常增生、高分化鱗癌及其頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中陽性表達情況

3 討 論

目前研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在人類多種惡性腫瘤中存在過表達情況[11]。Aebersold等[12]用免疫組化方法檢測98例人口腔鱗癌組織中HIF-1α的表達情況，發(fā)現(xiàn)94%的腫瘤組織中都存在著HIF-1α高表達。王世霞[13]采用免疫組化法檢測10例正?？谇火つそM織和58例口腔鱗癌中HIF-1α的表達情況，發(fā)現(xiàn)HIF-1α在正?？谇火つぶ袔缀醪槐磉_,在口腔鱗癌中表達明顯增強，口腔鱗癌中HIF-1α表達與腫瘤大小、年齡、性別無相關(guān)關(guān)系,但與其病理分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)，提示HIF-1α在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。王霞[14]通過檢測地鼠頰囊癌模型中HIF-1α及相關(guān)基因在癌變過程中的表達情況，發(fā)現(xiàn)HIF-1α在單純增生組、輕度和中度異常組及正常組均未見表達，在重度異常增生組和鱗癌組出現(xiàn)異常表達，鱗癌組與重度異常增生組相比HIF-1α的表達有增高趨勢，說明HIF-1α在黏膜癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

因此，我們推斷不論是人類或是小鼠，HIF-1α在口腔癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要的作用。在癌癥形成的早期，局部缺氧使HIF-1α出現(xiàn)了陽性表達，促進了機體EPO增加和VEGF表達增強，使腫瘤局部的毛細血管和淋巴管通透性增加，促進了癌細胞的迅速增殖，使癌癥的惡性程度逐漸增強，但是當(dāng)癌癥發(fā)展到一定階段后，由于周圍豐富的毛細血管和淋巴管為癌細胞提供了良好的血運，不再存在缺氧的條件，因而HIF-1α的表達也就不再增強甚至出現(xiàn)表達缺失，但癌組織卻在不斷發(fā)展，惡性程度繼續(xù)增高。

本實驗采用免疫組化法在人類和小鼠正?？谇火つど掀ぞ匆娪屑毎尸F(xiàn)棕黃色著色，HIF-1α在正?？谇火つぶ袔缀醪槐磉_，與王世霞[13]的檢測結(jié)果相一致。本研究中，在人類和小鼠口腔黏膜異常增生組織中，HIF-1α陽性率較低，分別為25%和30%，且多為弱陽性表達，表現(xiàn)為基底膜區(qū)細胞的胞漿及個別細胞的胞核呈淡黃色著色；在人類和小鼠口腔高分化鱗癌中HIF-1α陽性表達較高，分別為100%和95%，表現(xiàn)為原發(fā)灶區(qū)大部分細胞的胞漿呈現(xiàn)棕黃色著色，在1例小鼠口腔黏膜癌中我們還發(fā)現(xiàn)有多個癌巢的角化珠呈現(xiàn)明顯的棕黃色著色；在人類和小鼠口腔高分化鱗癌頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中分別有3例和2例轉(zhuǎn)移灶中的細胞胞漿及個別胞核呈現(xiàn)淡黃色著色，HIF-1α均為弱陽性表達，陽性率分別為15%和10%。通過比較，我們發(fā)現(xiàn)人類與小鼠在正常上皮、異常增生、高分化鱗癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶相應(yīng)階段中HIF-1α陽性表達相似。HIF-1α的陽性表達率及著色強度由正常上皮→異常增生→高分化鱗癌逐漸升高增強，在人高分化鱗癌組織中HIF-1α陽性表達率達到100%。我們檢測的小鼠中HIF-1α在異常增生階段的陽性表達結(jié)果與王霞[14]的HIF-1α在地鼠頰囊癌模型輕中度異常組未見表達不同，與重度異常增生組和鱗癌組出現(xiàn)的異常表達相同，我們推測可能與實驗所用的鼠類不同有關(guān)。同時，我們檢測的人和小鼠口腔高分化鱗癌頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中分別僅有3例和2例HIF-1α陽性表達，推測盡管原發(fā)灶癌細胞缺氧程度較深而導(dǎo)致HIF-1α表達明顯增高，但是尚屬早期的鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶血運良好，癌細胞微環(huán)境并未受到明顯改變，不存在明顯的缺氧，因而不會誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶上調(diào)和抑制E-鈣黏蛋白表達，使癌細胞失去粘連并降解基質(zhì)，啟動播散過程，因此也就不會導(dǎo)致HIF-1α的表達上升，所以HIF-1α的陽性表達率較低。

通過檢測人類與小鼠在正?？谇火つど掀?、異常增生、高分化鱗癌及其頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的HIF-1α表達，使我們對口腔黏膜病變的發(fā)生發(fā)展有了進一步的了解，同時也有助于我們判斷病變的性質(zhì)并做出正確的診療措施。總之，HIF-1α是我們了解口腔黏膜病變的可靠指標(biāo)。