王云梅, 夏 惠, 周桂虹, 劉芯伶, 林芷儀, 梁 東

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院, 四川 成都 611130；2.汶川縣科學(xué)技術(shù)和農(nóng)業(yè)畜牧局, 四川 阿壩藏族羌族自治州 623000)

干旱脅迫導(dǎo)致葡萄生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生生理障礙，產(chǎn)量降低，漿果品質(zhì)受到影響，是制約葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要環(huán)境因子之一[1]。褪黑素(melatonin，MT)是一種吲哚類小分子物質(zhì)，作為一種廣譜的生理調(diào)節(jié)劑存在于絕大多數(shù)生物有機(jī)體中[2]。在植物體中，MT可以調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[3]，并通過清除活性氧和自由基的強(qiáng)抗氧化作用提高植物對(duì)干旱[4]、鹽害[5]、重金屬[6]、UV輻射[7]、高溫[8]、冷害[9]等多種逆境的抗性。脫落酸(abscisic acid，ABA)作為五大植物激素之一，主要起著抑制生長(zhǎng)的作用；另一方面，ABA作為植物體細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)對(duì)非生物逆境響應(yīng)發(fā)揮著重要作用。在植物的干旱脅迫信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，有ABA-依賴型和ABA-非依賴型兩種途徑。ABA通過調(diào)節(jié)植株體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)，增強(qiáng)其抵御活性氧毒害的能力，從而緩解干旱脅迫的傷害[10]。而外施ABA對(duì)植物的影響與ABA濃度密切相關(guān)[11-13]。目前，MT和ABA抗旱作用的研究方法多以PEG滲透脅迫模擬干旱為主，不能真正反映干旱這一自然過程；此外，MT和ABA兩種物質(zhì)結(jié)合對(duì)干旱脅迫的效果及互作用關(guān)系還不清楚。

本研究以盆栽‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄扦插苗為材料，進(jìn)行MT根灌、ABA噴施、MT+ABA混施和干旱處理，通過測(cè)定葡萄葉片MDA、H2O2、光合色素和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量以及抗氧化酶活性的變化，探究外源MT和ABA對(duì)葡萄干旱脅迫響應(yīng)的生理機(jī)制以及MT和ABA之間的相互作用關(guān)系，以期為MT和ABA在果樹逆境中的生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)材料為‘陽(yáng)光玫瑰’(Shine-Muscat)葡萄扦插苗。于2017年冬季從四川農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地采集健壯的‘陽(yáng)光玫瑰’1 a生枝條，沙藏處理。于2018年3月進(jìn)行扦插，將枝條剪成長(zhǎng)約5 cm左右、帶一個(gè)飽滿芽的枝段，扦插在裝有營(yíng)養(yǎng)土、蛭石和沙子(體積比1∶1∶1)且直徑為13 cm、高度為15 cm的營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)。待生根后移入規(guī)格為(26 cm×22 cm)的塑料盆中，進(jìn)行常規(guī)澆水施肥管理。

待扦插苗長(zhǎng)至12～15片真葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的‘陽(yáng)光玫瑰’扦插苗60盆，平均分成5組，每組12盆，每盆1株，放入避雨棚進(jìn)行處理：(1)正常供水對(duì)照(CK)；(2)干旱對(duì)照處理(Dck)；(3)100 μmol·L-1的MT根灌處理(MT)；(4)50 μmol·L-1的ABA葉面噴施處理(ABA)；(5)100 μmol·L-1MT處理和50 μmol·L-1ABA處理(MT+ABA)。首先，MT組和MT+ABA組用MT預(yù)處理：19∶00根灌500 ml的MT溶液，每2 d根灌1次，共4次；同時(shí)其它處理組澆500 ml清水。然后，對(duì)(2)～(5)組進(jìn)行自然干旱處理，即不澆水；(1)組正常澆水，每2 d 1次，每次500 ml。ABA處理：在干旱處理第0、2、4、6、8 d和10 d的19∶00對(duì)ABA和MT+ABA處理組葉面分別噴施10 ml的50 μmol·L-1的ABA溶液；其它處理組噴施10 ml清水。在干旱脅迫處理的第0 d(以最后一次根灌MT溶液的第二天作為干旱脅迫第0d)、第18 d分別取各組植株4～8葉位的葉片，一部分用于測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)，另一部分-80℃液氮速凍后保存于-80℃，用于后續(xù)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2 測(cè)定指標(biāo)

1.2.1 土壤含水量和水勢(shì)及葉片相對(duì)含水量和水勢(shì)的測(cè)定 土壤含水量采用烘干稱重法測(cè)定；葉片水勢(shì)和土壤水勢(shì)使用型號(hào)為WP4C的水勢(shì)儀進(jìn)行測(cè)定；葉片相對(duì)含水量的測(cè)定參照Z(yǔ)egaoui等[14]的方法。

1.2.2 丙二醛(MDA)、H2O2和光合色素含量以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測(cè)定 MDA和H2O2含量、相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定參照Bai等[15]的方法；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的含量測(cè)定參照李合生等[16]的方法；光合色素含量的測(cè)定參照Sariyeva等[17]的方法。

1.2.3 抗氧化酶活性的測(cè)定 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定采用Mirzaee[18]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，比較每個(gè)處理組平均值，以P<0.05為差異顯著，使用SPSS 20. 0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)干旱脅迫下葡萄形態(tài)特征的影響

干旱脅迫下植物葉片呈現(xiàn)出不同形態(tài)變化，發(fā)生葉片黃化卷曲、萎蔫等，脅迫嚴(yán)重時(shí)甚至葉片會(huì)脫落。從圖1可以看出，在控水處理18 d時(shí)，干旱對(duì)照處理組(Dck)的葡萄植株中、下部出現(xiàn)部分葉片脫落、萎蔫和黃化；MT處理組僅出現(xiàn)葉片黃化，無落葉；ABA處理組葡萄葉片脫落和黃化；MT+ABA處理組與MT處理組表型相似，葉片黃化。正常供水對(duì)照處理(CK)的葉片形態(tài)特征沒有發(fā)生明顯的變化。

圖1 干旱脅迫下‘陽(yáng)光玫瑰’形態(tài)特征的變化Fig.1 The changes of morphological characteristics of ‘Shine-Muscat’ under drought stress

2.2 不同處理對(duì)干旱脅迫下土壤水分、葡萄葉片及根系水分的影響

表1數(shù)據(jù)表明，在控水條件下水分不斷蒸發(fā)，土壤含水量逐漸降低?？厮?8 d，干旱對(duì)照(Dck)處理的土壤含水量比正常供水處理降低了64.35%。土壤水勢(shì)的變化與含水量變化一致，呈顯著性降低，但各處理間無顯著性差異。

表1 不同處理對(duì)干旱脅迫下葡萄土壤含水量、土壤水勢(shì)、葉片相對(duì)含水量、葉片水勢(shì)和根系含水量的影響

干旱處理下Dck、MT、ABA和MT+ABA處理的葉片相對(duì)含水量均顯著低于對(duì)照(CK)處理。其中MT+ABA處理組最低，僅為CK處理的91.66%，其次是Dck和ABA組，兩者無顯著差異，MT組的葉片相對(duì)含水量高于Dck、ABA和MT+ABA。在干旱脅迫下葉片水勢(shì)較CK顯著降低。與干旱對(duì)照Dck相比，MT、ABA和MT+ABA處理進(jìn)一步降低了葉片水勢(shì)，在MT+ABA處理下達(dá)到最低值-6.08 MPa。

干旱脅迫導(dǎo)致植株根系含水量顯著降低?？厮幚?8 d后，Dck、MT、ABA和MT+ABA處理組的根系含水量都顯著低于對(duì)照處理(CK)；ABA和MT+ABA處理組的幼苗根系含水量顯著低于其他干旱處理組，分別達(dá)到68.26%和71.64%，說明ABA處理加速了葡萄根系中水分的散失。

2.3 不同處理對(duì)干旱脅迫下葡萄葉片膜脂過氧化程度的影響

干旱脅迫導(dǎo)致活性氧大量累積，造成細(xì)胞膜脂過氧化。由圖2A可知，干旱處理0 d時(shí)，MT和MT+ABA處理的葡萄葉片MDA的含量低于其他處理，但差異不顯著；正常供水對(duì)照處理(CK)的MDA含量在干旱脅迫18 d時(shí)顯著高于0 d。干旱處理18 d后的葡萄葉片MDA含量顯著高于正常供水處理；MT和MT+ABA處理的MDA含量卻顯著低于干旱對(duì)照處理，而ABA處理的MDA含量顯著高于其他處理，達(dá)到最高值，為20.49 μmol·g-1。

干旱處理0 d，ABA處理的‘陽(yáng)光玫瑰’幼苗H2O2含量高于CK和MT+ABA處理，但CK、Dck、MT和MT+ABA之間差異不顯著。干旱處理18 d后，正常供水對(duì)照處理的H2O2含量顯著低于干旱處理0 d；Dck處理的H2O2含量顯著高于CK處理，達(dá)到66.10 mmol·L-1；MT、ABA和MT+ABA處理下H2O2含量顯著低于Dck處理，且ABA處理下的含量最低，為27.69 mmol·L-1(圖2B)。

植物在逆境脅迫下細(xì)胞膜透性增大，相對(duì)電導(dǎo)率升高。干旱處理0 d各處理的葉片相對(duì)電導(dǎo)率差異不顯著。干旱處理18 d后的CK處理與0 d無明顯差異；Dck、MT、ABA和MT+ABA處理的相對(duì)電導(dǎo)率高于CK對(duì)照處理，在ABA單一處理下的相對(duì)電導(dǎo)率最高，達(dá)到43.15%；MT處理和MT+ABA處理下相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于Dck處理，緩解了干旱脅迫導(dǎo)致的電解質(zhì)泄漏(圖2C)。

2.4 不同處理對(duì)干旱脅迫下葡萄光合色素的影響

干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致植物葉片發(fā)黃失綠、萎蔫，甚至脫落。從圖3可以看出，干旱處理0 d不同處理葡萄幼苗葉片葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量均無顯著差異。干旱處理18 d后，正常供水處理(CK)相比于0 d各光合色素含量顯著增加；干旱脅迫導(dǎo)致各光合色素含量分別下降了14.30%、25.04%、17.23%和20.67%，而在外源MT處理和MT+ABA處理下葉片各光合色素含量均顯著增加；ABA處理的各光合色素含量較低，但與MT和MT+ABA處理相比差異不顯著，說明外源施用MT有效抑制了干旱脅迫造成的葉片光合色素的降解。

圖3 褪黑素和脫落酸對(duì)干旱脅迫下葡萄葉片葉綠素a(A)、葉綠素b(B)、總?cè)~綠素(C)和類胡蘿卜素(D)含量的影響Fig.3 Effects of MT and ABA on chlorophyll a (A), Chlorophyll b (B), total chlorophyll (C), and carotenoid (D) contents in leaves of grape under drought stress

2.5 不同處理對(duì)干旱脅迫下葡萄滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

脯氨酸是植物體內(nèi)非常重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量的多少與植物抗旱性密切相關(guān)。由圖4A可以看出控水處理0 d時(shí)，經(jīng)MT預(yù)處理的幼苗游離脯氨酸含量略高于其他處理，但差異不顯著?？厮幚?8 d，干旱處理導(dǎo)致葡萄幼苗游離脯氨酸含量升高了64.82%；MT處理和MT+ABA處理的游離脯氨酸含量顯著降低，在MT+ABA處理下達(dá)到最低值5.50 mg·g-1，而外源噴施ABA使其含量顯著上升，達(dá)到最大值15.41 mg·g-1。正常供水處理(CK)其脯氨酸含量與0 d相比差異不顯著。

干旱處理0d的葡萄幼苗葉片可溶性糖含量和可溶性蛋白含量均無明顯變化。干旱處理18 d時(shí)，正常供水(CK)處理的可溶性糖含量與0 d相比無顯著性差異，但可溶性蛋白含量降低了26.97%；干旱脅迫(Dck)導(dǎo)致幼苗可溶性糖含量和可溶性蛋白含量迅速增加，分別上升了25.69%和80.03%。在MT、ABA和MT+ABA處理下的可溶性糖含量顯著降低；MT+ABA處理的幼苗可溶性糖含量最低，為1.36 mg·g-1。經(jīng)MT單獨(dú)預(yù)處理，其幼苗可溶性蛋白的含量最低，為251.03 mg·g-1(圖4B、4C)。

圖4 褪黑素和脫落酸對(duì)干旱脅迫下葡萄葉片游離脯氨酸(A)、可溶性糖(B)和可溶性蛋白(C)含量的影響Fig.4 Effects of MT and ABA on the contents of proline (A), soluble sugar (B), and soluble protein (C) in leaves of ‘Shine-Muscat’ under drought stress

2.6 不同處理對(duì)干旱脅迫下葡萄抗氧化酶活性的影響

在干旱脅迫下超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)作為保護(hù)細(xì)胞的重要酶類，能夠清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧。SOD參與植物體內(nèi)的氧化代謝，能夠催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，生成O2和H2O2，保護(hù)細(xì)胞免遭逆境造成的過氧化傷害。從圖5可以看出，干旱處理18 d后，干旱對(duì)照處理(Dck)的SOD活性比正常供水處理CK降低了8.88%，而MT、ABA和MT+ABA處理的幼苗SOD活性顯著升高，且在MT+ABA處理下其活性顯著低于MT處理和ABA處理(圖5A)。

POD和CAT能夠通過分解H2O2從而對(duì)植物起到一定的保護(hù)作用?？厮幚?8 d，幼苗POD活性顯著高于正常供水(CK)處理，外源物質(zhì)處理顯著增加了POD活性，且ABA處理下其活性最高，達(dá)到了17.91 U·min·mg-1；MT+ABA處理的POD活性顯著低于MT處理和ABA處理(圖5B)。由圖5C可以看出，干旱處理0 d，MT處理降低了CAT活性，干旱18d 時(shí)CAT活性相比于正常供水(CK)處理顯著升高了59.31%，MT、ABA和MT+ABA處理顯著降低了其活性，但3組處理之間差異不顯著。

圖5 褪黑素和脫落酸對(duì)干旱脅迫下葡萄葉片超氧化物歧化酶(SOD)(A)、過氧化 物酶(POD)(B)和過氧化氫酶(CAT)(C)活性的影響Fig.5 Effects of MT and ABA on the activities of SOD (A), POD (B) and CAT (C) activity in leaves of ‘Shine-Muscat’ under drought stress

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫下不同外源物質(zhì)處理會(huì)對(duì)植物缺水反應(yīng)產(chǎn)生不同的影響，緩解或加重干旱的傷害，同時(shí)使用它們可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同或拮抗作用。因此，在本研究中，通過外源施用MT、ABA及其相互結(jié)合處理，評(píng)價(jià)與干旱適應(yīng)相關(guān)的表型和生理指標(biāo)的變化，對(duì)葡萄幼苗抗旱性及MT與ABA的相互作用關(guān)系進(jìn)行了研究。

干旱脅迫下單獨(dú)或共同施用MT和ABA對(duì)葡萄幼苗的表型及生理特性有顯著的影響。如圖1表型所示，MT處理和MT+ABA處理減輕了干旱脅迫對(duì)葡萄幼苗葉片產(chǎn)生的黃化、脫落等毒性癥狀。研究表明光合色素很容易遭受逆境脅迫的傷害[19]，本研究中MT處理增加了干旱脅迫下光合色素的含量(圖3)，這與Kostopoulou等[20]對(duì)于MT的研究結(jié)果一致，說明MT削弱了植物體內(nèi)的過氧化作用，緩解了干旱脅迫造成的損傷。50 μmol·L-1的ABA處理對(duì)光合色素的影響可能是由于對(duì)葡萄幼苗來說該濃度的ABA過高，對(duì)植物產(chǎn)生了毒害作用，降低了植物光合系統(tǒng)的穩(wěn)定性和光合速率，從而阻礙了光合色素的合成或加速了光合色素的降解[12]。MT+ABA處理的作用與MT處理趨近，說明在MT+ABA處理下MT的促進(jìn)作用緩解了ABA濃度過高所造成的傷害。

葉片水勢(shì)的高低和相對(duì)含水量的多少可以準(zhǔn)確地反映干旱脅迫下植物葉片的水分狀況和受到土壤缺水的影響程度[21]。水分脅迫下，植物不僅要從低水勢(shì)的介質(zhì)中吸收水分來維持植物體內(nèi)的水分平衡，還要維持壓力勢(shì)基木不變以保證生理生化過程的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，所以通過降低滲透勢(shì)來進(jìn)行調(diào)節(jié)是極其重要的一種方式，而滲透勢(shì)與細(xì)胞內(nèi)多種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)密切相關(guān)[22]。干旱脅迫下外源物質(zhì)處理進(jìn)一步降低了葉片的水勢(shì)(表1)，可能是MT和ABA的施用雖然降低了脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，卻大幅度提高了山梨醇、淀粉和蔗糖等其他滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的水平[23]，導(dǎo)致細(xì)胞滲透勢(shì)降低，從而降低了葉片水勢(shì)。葉君等[24]研究表明MT處理可增加干旱下小麥幼苗的根冠比，而根冠比增加有助于提高植物的吸水能力，維持植物組織含水量。適宜濃度ABA可以促進(jìn)小麥幼苗的生長(zhǎng)，而高濃度ABA則會(huì)產(chǎn)生抑制作用[25]。本研究中ABA處理降低了根系含水量，可能是ABA濃度過高對(duì)葡萄幼苗產(chǎn)生了抑制作用，加速了葡萄葉片水分的蒸騰，植物為了維持正常的生理代謝從而增強(qiáng)了地下根部水分向地上部的運(yùn)輸。

脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以維持細(xì)胞狀態(tài)，最大限度地減少水分虧缺帶來的不利影響[26]。干旱脅迫導(dǎo)致葡萄幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的含量顯著升高，這種變化是由于滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累增強(qiáng)了葡萄幼苗自身的滲透調(diào)節(jié)水平以應(yīng)對(duì)干旱脅迫[27]。外源MT處理降低了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，維持了細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)水平的穩(wěn)定。ABA處理顯著增加了游離脯氨酸的含量，其滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)整體水平高于MT處理，提高了滲透脅迫的整體水平，而MT+ABA處理的效果與MT處理相似(圖4)。由此推測(cè)，外源MT與ABA相互作用減輕了ABA濃度過高帶來的抑制作用，有效地調(diào)節(jié)了逆境下植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)水平，維持了植物的正常生理代謝，從而提高了植物的抗旱性。

逆境會(huì)打破植物體細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除的平衡，造成活性氧產(chǎn)生增加，膜透性增大，從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[28-29]。適宜濃度的MT可降低活性氧積累，減輕膜脂過氧化程度，提高植物氧自由基清除能力[30]。王娟[31]研究發(fā)現(xiàn),適宜濃度的ABA能夠維持煙草幼苗葉片細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，從而緩解干旱脅迫對(duì)煙草幼苗的損傷，而隨著干旱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，高濃度ABA噴施處理效果不明顯。本試驗(yàn)中，雖然干旱脅迫增加了活性氧對(duì)植株造成明顯的損傷，但MT處理和MT+ABA處理能夠降低MDA和相對(duì)電導(dǎo)率水平，控制細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性，減輕干旱傷害。相反，ABA處理下MDA含量顯著增加，相對(duì)電導(dǎo)率升高(圖2)，推測(cè)是由于ABA的濃度過高加重了幼苗的氧化損傷，這與趙春章等[32]的研究結(jié)果相似，其研究表明長(zhǎng)期高濃度ABA(20 mg·L-1)處理不利于云杉幼苗生長(zhǎng)，而MT清除活性氧的能力抵消或者部分減輕了ABA的效應(yīng)。

植物葉片中抗氧化酶SOD、POD和CAT的協(xié)同作用可以有效清除植物體內(nèi)多余的活性氧，共同抵抗干旱脅迫所造成的氧化損傷，在逆境脅迫中發(fā)揮著重要的作用[33]。已有研究表明，干旱脅迫下甘藍(lán)型油菜抗氧化酶活性提高，外源MT顯著提高了SOD和POD的活性[34]。適宜濃度ABA還可以誘導(dǎo)某些酶的重新合成從而提高植物的抗旱性[35]。在本研究中，干旱脅迫顯著降低了SOD活性，使POD和CAT活性升高，而外源MT處理通過提高SOD和POD活性，并降低CAT活性加強(qiáng)了酶促系統(tǒng)的抗旱能力，對(duì)清除植物體內(nèi)多余活性氧的積累、減輕膜脂過氧化程度產(chǎn)生了一定的積極作用。ABA處理下抗氧化酶的變化與MT相似，這與本試驗(yàn)中其他脅迫指標(biāo)的變化相反，有可能是ABA濃度過高，長(zhǎng)期處理對(duì)葡萄產(chǎn)生的消極影響超出了抗氧化系統(tǒng)防御能力的限度，致使SOD和POD的活性達(dá)到最高值。與其他脅迫相關(guān)指標(biāo)的變化相似，MT與ABA結(jié)合處理下，兩者相互作用減弱了高濃度ABA造成的傷害，同時(shí)削弱了MT對(duì)于干旱脅迫的作用效果，但其具體的作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。