張漢卿, 秦偉捷, 張養(yǎng)軍*

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)研究生院, 安徽 合肥 230032; 2. 軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所, 北京蛋白質(zhì)組研究中心, 蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102206)

蛋白質(zhì)的糖基化作為細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制的關(guān)鍵途徑之一,在多種生物過程中扮演著至關(guān)重要的角色,如細(xì)胞免疫、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞生長與分化、蛋白質(zhì)降解以及炎癥產(chǎn)生等[1-4]。目前針對N-糖基化蛋白的研究策略主要是先將蛋白酶切成肽段后再進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,在這一過程中,由于生物樣品中存在高豐度非糖肽的抑制,使N-糖基化肽段的質(zhì)譜分析變得尤為困難。因此,發(fā)展從復(fù)雜生物樣本中選擇性富集N-糖肽對糖蛋白質(zhì)組的研究至關(guān)重要。

近年來,已發(fā)展出多種不同原理的方法用于N-糖基化肽段的富集分離,包括凝集素親和層析法、酰肼化學(xué)法、親水作用色譜法和硼酸化學(xué)法等。凝集素親和層析法是目前使用較為廣泛的糖基化肽段富集方法,然而凝集素只針對特殊的聚糖發(fā)生特異性反應(yīng),阻礙了糖基化肽段的整體鑒定分析[5]。酰肼化學(xué)法是利用酰肼基團(tuán)和糖肽之間形成的特異性共價(jià)鍵，以達(dá)到對糖肽的準(zhǔn)確識(shí)別，但該方法程序頗為復(fù)雜且耗時(shí),并遺失了聚糖的部分結(jié)構(gòu)信息[6]。親水作用色譜法優(yōu)點(diǎn)在于提供完整碳水化合物基團(tuán)信息,但由于相互作用弱,限制了在復(fù)雜生物樣本中的選擇性和靈敏度[7]。硼酸化學(xué)法優(yōu)點(diǎn)在于可以提供完整碳水化合物基團(tuán)信息,因其操作簡便、適應(yīng)性廣和兼容性好等優(yōu)點(diǎn),在糖基化肽段的富集方面受到越來越多的關(guān)注[8-10]。但是現(xiàn)有的富集工具常常存在選擇性差、空間位阻大等問題,經(jīng)常導(dǎo)致其在復(fù)雜生物樣本應(yīng)用中靈敏度差,負(fù)載量低等。因此,開發(fā)一種性質(zhì)穩(wěn)定、富集效率高的糖基化肽段富集材料具有十分重要的意義。

得益于功能材料的快速發(fā)展,越來越多的納米材料被成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的領(lǐng)域當(dāng)中,如二氧化硅、石墨烯和金屬有機(jī)框架(MOFs)等[11-14]。二硫化鉬(MoS2)作為一種重要的類石墨烯的二維層狀納米材料,由于其特有的物理化學(xué)性質(zhì),在析氫反應(yīng)、復(fù)合材料和疾病治療診斷等不同領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注[15-18]。相比于二氧化硅等材料的三維立體結(jié)構(gòu),類石墨烯的二硫化鉬呈現(xiàn)出納米尺度的二維層狀形態(tài),其末端裸露的活性硫原子提供了大量的可修飾位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上,本研究利用快速便捷的兩步“金-硫”(Au-S)反應(yīng)在二硫化鉬表面上負(fù)載4-巰基苯硼酸(4-MPB)制備出新型功能納米復(fù)合材料MoS2/Au/4-MPB。超薄二維層狀納米結(jié)構(gòu)的二硫化鉬具有較小的分子間阻力,能有效減少材料間的非特異性吸附與傳質(zhì)阻力。此外,4-巰基苯硼酸對糖基化肽段的高度選擇能力使得復(fù)合材料在實(shí)際生物樣本檢測中展現(xiàn)出高效的N-糖基化肽段選擇性,為糖基化蛋白質(zhì)組深度覆蓋分析提供了一種新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Hitachi 4800發(fā)射掃描電子顯微鏡(日立,日本), FEI Tecnai G20透射電子顯微鏡(FEI,美國), Bruker D8 Advance衍射儀、Ultrafle Xtreme MALDI TOF/TOF基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Bruker,德國), SDTQ600熱分析儀(TA,美國), Nano Drop 2000C超微量分光光度計(jì)、Easy NLC-1000 LC-MS/MS納升級液相色譜-串聯(lián)Q Exactive Plus質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific,美國), Zeta View PMX 110納米顆粒跟蹤分析儀(Particle Metrix,德國), Concentrator plus真空離心濃縮儀(Eppendorf,德國)。

1.2 MoS2/Au/4-MPB復(fù)合納米材料的制備

1.2.1MoS2納米材料的制備

依據(jù)文獻(xiàn)方法[19,20],經(jīng)過對溶劑熱法進(jìn)行適當(dāng)修改制備超薄二硫化鉬納米材料。將1.21 g Na2MoO4·2H2O、1.52 g (NH2)2CS、和30 mg PEG-20000加入30 mL超純水中,機(jī)械攪拌30 min,超聲渦旋獲得均一透明的溶液。將所得溶液轉(zhuǎn)移至50 mL不銹鋼高壓反應(yīng)釜中密封,于220 ℃下加熱反應(yīng)24 h后,冷卻至室溫。將反應(yīng)產(chǎn)物在1 500 g條件下離心15 min,移取沉淀,依次使用30 mL超純水、30 mL乙醇洗滌沉淀兩次,30 mL去離子水洗滌沉淀3次,每次洗滌在1 500 g條件下離心15 min,移取沉淀。最后將所得黑色粉末在60 ℃真空條件下干燥6 h,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2MoS2/Au/4-MPB納米復(fù)合材料的制備

依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[21,22]的制備方法適當(dāng)修改，用于新型功能納米復(fù)合材料的制備。將20 mg MoS2黑色粉末、3 mg三水合四氯化金(Ⅲ)、100 μL油胺和150 μL三異丙基硅烷混合于3 mL正己烷中,室溫靜置4 h,分別使用正己烷和乙醇清洗,向所得沉淀中加入4 mL含20 mg 4-巰基苯硼酸的乙醇溶液,在室溫條件下振蕩混合12 h。使用離心方法將所得沉淀依次使用5 mL去離子水、乙醇洗滌兩次,將沉淀在60 ℃真空條件下干燥4 h，得到黑色粉末,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 標(biāo)準(zhǔn)蛋白與尿液外泌體蛋白的制備

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶切

稱取1 mg IgG和1 mg BSA，分別溶解在1 mL 50 mmol/L碳酸氫銨(pH=8.4)中,使其質(zhì)量濃度為1 μg/μL,加入100 mmol/L的DTT 111 μL(終濃度為10 mmol/L),于60 ℃下加熱還原1 h,隨后降至室溫;加入500 mmol/L的IAA 111 μL(終濃度為50 mmol/L),于室溫、暗處烷基化反應(yīng)30 min。以胰蛋白酶與蛋白質(zhì)質(zhì)量比1∶50的比例加入胰蛋白酶,于37 ℃下恒溫孵育過夜。孵育結(jié)束后使用C18脫鹽柱進(jìn)行脫鹽分裝,于45 ℃真空離心濃縮,于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存，備用。

1.3.2尿液外泌體蛋白的提取及酶切

尿液采集:采集3名20～25歲健康成年男性志愿者晨起首次排尿尿液50 mL,然后立即處理,無需保存。

尿液外泌體蛋白提取:使用Thery等[23,24]的方法,以300 g離心10 min、2 000 g離心10 min和10 000 g離心30 min分別去除全細(xì)胞、死細(xì)胞和細(xì)胞碎片;將上清液以110 000 g離心70 min,得到的沉淀為外泌體的粗提取物;將獲得的外泌體粗提取物使用1×PBS洗滌2次(110 000 g, 70 min),去除污染蛋白質(zhì),得到外泌體。提取的尿液外泌體使用8 mol/L尿素復(fù)溶,使用超聲波細(xì)胞破碎儀200 W破碎30 min提取蛋白質(zhì),將提取的蛋白質(zhì)于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存，備用。

尿液外泌體蛋白酶切:使用超濾管酶切(FASP)[25],將提取的外泌蛋白溶液加入30 kDa超濾管,使用8 mol/L尿素以14 000 g離心洗滌12 min,重復(fù)1次,之后加入終濃度10 mmol/L DTT,于37 ℃還原4 h;繼續(xù)使用8 mol/L尿素以14 000 g離心12 min洗滌2次,去除DTT;隨后向超濾管中加入終濃度為50 mmol/L的IAA,于室溫暗處烷基化反應(yīng)30 min。分別使用8 mol/L尿素、50 mmol/L碳酸氫銨(pH=8.4)以14 000 g、12 min離心清洗3次。使用Nano Drop檢測樣本濃度,以胰蛋白酶與蛋白質(zhì)質(zhì)量比1∶50加入胰蛋白酶,于37 ℃恒溫孵育12 h;將恒溫孵育后的樣本以14 000 g離心12 min獲得濾液,之后加入100 μL超純水再次離心,留超濾液測量肽段濃度,于45 ℃真空離心濃縮后，于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存，備用。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)樣品中糖肽的富集

參考之前的文獻(xiàn)[26]方法并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。將含有2 μg IgG酶解肽段的100 μL富集緩沖液(50 mmol/L碳酸氫銨,pH=8.4)與50 μg MoS2/Au/4-MPB混合,振蕩30 min進(jìn)行N-糖肽的富集;使用100 μL富集緩沖液離心洗滌3次,去除未吸附樣本,再加入50 μL洗脫緩沖液(ACN-H2O-TFA, 30∶69∶1, v/v/v)振蕩1 min,洗脫吸附的N-糖肽,通過C8膜將洗脫液與材料分離,洗脫液于45 ℃真空離心濃縮后于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PNGase F酶去糖基化

1.6 分析條件

MALDI-TOF MS:脈沖激光波長設(shè)置為337 nm,加速電壓20 kV采集質(zhì)譜圖。使用ACN-H2O-H3PO4(70∶29∶1, v/v/v)配制DHB溶液(25 mg/mL)作為基質(zhì)溶液。將樣品(0.5 μL)和基質(zhì)溶液(0.5 μL)混合點(diǎn)在靶板上,于室溫下干燥，然后用MALDI-TOF MS分析。

LC-MS/MS:將酶切后的肽段復(fù)溶于0.1%(v/v)FA水溶液中,通過LC-MS/MS分析。流動(dòng)相A為0.1%(v/v)FA水溶液;流動(dòng)相B為含0.1%(v/v)FA的乙腈溶液。在C18反相分析柱(1.9 μm)上以600 nL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫。洗脫梯度:0～16 min, 5%B～12%B; 16～51 min, 12%B～24%B; 51～66 min, 24%B～32%B; 66～67 min, 32%B～95%B; 75 min, 95%B。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集在數(shù)據(jù)依賴模式下(data-dependent acquisition, DDA)模式下進(jìn)行,設(shè)置一級質(zhì)譜全掃描范圍為300～1 400 Da,掃描分辨率為120 000,選擇一級質(zhì)譜中豐度最高的20個(gè)母離子經(jīng)高能碰撞誘導(dǎo)解離模式(higher-energy collisional dissociation, HCD)后進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,分辨率為15 000,離子注入時(shí)間為35 ms,高能誘導(dǎo)解離能量為35%。

1.7 數(shù)據(jù)檢索

使用MaxQuant軟件(版本1.6.4.3)對LC-MS/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索,數(shù)據(jù)庫為UniProt人類蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(July 2015, 20207)。檢索條件:選擇胰蛋白酶作為蛋白水解酶,最大允許兩個(gè)漏切位點(diǎn);半胱氨酸氨基脲甲基化(carbamidomethyl, C)設(shè)置為固定修飾;甲硫氨酸氧化(oxidation, M)、蛋白質(zhì)N-末端乙?；?acetyl, proteinN-term)和脫酰胺基(deamidated,18O)設(shè)置為可變修飾;母離子和碎片離子的最大質(zhì)量容差分別設(shè)置為1.5×10-5mg/L和0.5 Da,蛋白質(zhì)的假陽性率(FDR)水平為1%。在搜索結(jié)果中,只有包含N#XSer/Thr/Cys(N#表示糖基化位點(diǎn)，X是除脯氨酸之外的任一氨基酸)固定氨基酸序列和脫酰胺基18O(N)的肽段才被確定為N-糖肽。

2 結(jié)果與討論

2.1 MoS2/Au/4-MPB功能納米復(fù)合材料的表征

MoS2/Au/4-MPB功能納米復(fù)合材料的制備過程見圖1。首先在MoS2二維層狀表面通過“Au-S”反應(yīng)固定納米金線,然后再次通過“Au-S”反應(yīng)使納米金線與4-MPB進(jìn)行特異性結(jié)合,將4-MPB負(fù)載在MoS2表面,得到MoS2/Au/4-MPB功能納米復(fù)合材料。

圖 1 MoS2/Au/4-MPB功能納米復(fù)合材料的制備流程圖Fig. 1 Functional nanocomposite preparation workflow of molybdenum disulfide/gold/4-mercaptophenylboronic acid (MoS2/Au/4-MPB)

圖 2 (a)MoS2掃描電鏡圖、(b)透射電鏡圖以及(c)MoS2/Au透射電鏡圖Fig. 2 (a) Scanning electron microscope (SEM) image of the MoS2, (b) transmission electron microscope (TEM) image of the (b) MoS2 and (c) MoS2/Au

使用掃描電鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)對合成材料的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。如圖2所示,合成的二硫化鉬呈現(xiàn)半透明“萬花筒”狀結(jié)構(gòu),可以為后續(xù)反應(yīng)提供大量的可修飾位點(diǎn)。如圖2a和圖2b所示,二硫化鉬直徑分布約為70～300 nm,符合納米材料的尺寸特征(1～100 nm)。由圖2c可以看出,在固定金納米顆粒后大量納米金線(直徑約為10 nm)均勻分布于超薄二維二硫化鉬納米材料表面,增加了二維二硫化鉬納米材料的表面活性位點(diǎn),有利于修飾大量的活性基團(tuán)4-巰基苯硼酸。

圖 3 (a) 4-MPB、MoS2/Au/4-MPB的紅外光譜圖、(b) MoS2、MoS2/Au/4-MPB的X射線衍射圖譜和(c) MoS2/Au、MoS2/Au/4-MPB的熱重曲線圖Fig. 3 (a) FT-IR spectra of 4-MPB and MoS2/Au/4-MPB, (b) X-ray diffraction patterns of MoS2 and MoS2/Au/4-MPB and (c) thermogravimetric analyzer (TGA) curves of MoS2/Au and MoS2/Au/4-MPB

此外,實(shí)驗(yàn)還使用不同表征方法進(jìn)行表征，以確定MoS2/Au/4-MPB納米復(fù)合材料的組成和性能。首先,對制備的材料進(jìn)行了紅外光譜(IR)分析,如圖3a所示,合成后MoS2/Au/4-MPB在500～1 500 cm-1出現(xiàn)與4-MPB相似的指紋峰,表明4-MPB已成功連接到MoS2/Au復(fù)合材料上。對制備的材料進(jìn)行X射線衍分析,結(jié)果如圖3b所示,可以看出,在14°(002)、33°(101)、40°(222)、59°(110)處的衍射峰,與2H-MoS2的標(biāo)準(zhǔn)圖譜所對應(yīng)的特征峰位匹配(JCPDS 37-1492),說明該方法可以制備均一穩(wěn)定的二維二硫化鉬納米材料。在負(fù)載納米金線后,在64.5°(221)、77.6° (311)處出現(xiàn)Au的特征峰(JCPDS 79-0418)。這些特征峰表明金納米顆粒成功固定在二硫化鉬納米材料表面。

進(jìn)一步通過熱重分析(TGA)評價(jià)4-MPB的負(fù)載量,如圖3c所示,在400～800 ℃后,新型功能復(fù)合材料的熱重?fù)p失達(dá)到16.8%,這是由于復(fù)合材料中4-巰基苯硼酸的熱分解而形成,表明大量的4-巰基苯硼酸成功修飾在納米金線上，并負(fù)載在二硫化鉬納米材料表面。

圖 4 IgG胰蛋白酶消化物(1 μg)的MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig. 4 Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) spectra of immunoglobulin G (IgG) tryptic digest (1 μg)a. direct analysis; b. after enrichment by MoS2/Au/4-MPB; c. after enrichment by MoS2/Au/4-MPB and deglycosylation by PNGase F.

2.2 MoS2/Au/4-MPB納米復(fù)合材料用于富集標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶切的糖肽

為了考察MoS2/Au/4-MPB納米復(fù)合材料對糖肽的富集性能,實(shí)驗(yàn)采用IgG的胰蛋白酶酶解產(chǎn)物(1 μg)作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，并選擇50 mmol/L碳酸氫銨(pH=8.4)作為富集緩沖液[12,26]。如圖4a所示,在富集前,IgG酶切產(chǎn)物質(zhì)譜圖中被大量的高豐度非糖肽峰占據(jù),當(dāng)使用MoS2/Au/4-MPB納米復(fù)合材料富集后,非糖基化肽段在質(zhì)譜圖上幾乎消失,同時(shí)富集到32條歸屬于IgG蛋白的N-糖肽(見圖4b和附表S1,詳見www-chrom-China.com)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證MoS2/Au/4-MPB富集所得的糖基化肽段的準(zhǔn)確性,將富集所獲得的產(chǎn)物經(jīng)PNGase F酶處理,去除N-糖鏈后再進(jìn)行MALDI-TOF MS分析,如圖4c所示,去糖基化后可以鑒定到2條肽段的質(zhì)譜峰(m/z=1 158和1 190),與文獻(xiàn)[27]相符合,同時(shí)原有的糖基化肽段質(zhì)譜峰消失,進(jìn)一步說明富集產(chǎn)物質(zhì)譜圖中的各個(gè)質(zhì)譜峰均歸屬于IgG胰蛋白酶酶切產(chǎn)物中的N-糖基化肽。上述結(jié)果表明,4-巰基苯基硼酸中獨(dú)特的硼酸基團(tuán)對N-糖肽具有高度的選擇性,MoS2/Au/4-MPB功能納米復(fù)合材料對N-糖基化肽段具有優(yōu)異的富集性能。

圖 5 MoS2/Au/4-MPB富集IgG胰蛋白酶消化物的MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig. 5 MALDI-TOF MS spectra of IgG tryptic digest enriched by MoS2/Au/4-MPBa. 1 pmol; b. 100 fmol; c. 5 fmol.

為了考察MoS2/Au/4-MPB功能納米復(fù)合材料對N-糖基化肽段的富集靈敏度,實(shí)驗(yàn)制備了系列不同濃度的IgG胰蛋白酶酶切產(chǎn)物,對富集材料的富集靈敏度進(jìn)行了考察。如圖5所示,當(dāng)IgG的用量為1 pmol(見圖5a)和100 fmol(見圖5b)時(shí),通過MoS2/Au/4-MPB分別富集到18條和12條N-糖肽;當(dāng)IgG的用量低至5 fmol(見圖5c)時(shí),仍有2個(gè)N-糖基化肽段可以被精確檢測到,表明了MoS2/Au/4-MPB功能納米復(fù)合材料對低豐度糖肽的具有高的富集能力。與之前報(bào)道的有關(guān)富集材料TCNBA[9]、GO/Fe3O4/Au/PEG[13]相比,MoS2/Au/4-MPB的檢測靈敏度要高2～50倍。表明MoS2/Au/4-MPB在分析微量N-糖肽樣本中有巨大優(yōu)勢。

圖 6 MoS2/Au/4-MPB富集IgG和BSA胰蛋白酶消化物混合物的MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig. 6 MALDI-TOF-MS spectra of N-glycopeptides enriched from the mixture of tryptic digested IgG and bovine serum albumin (BSA) by MoS2/Au/4-MPBa. before enrichment; b and c. after enrichment (amount of substance ratios of IgG to BSA were 1∶100 and 1∶1000).

為了進(jìn)一步驗(yàn)證MoS2/Au/4-MPB功能納米復(fù)合材料的選擇性以及適用性,實(shí)驗(yàn)以物質(zhì)的量之比1∶100和1∶1 000(IgG∶BSA)的混合酶解液作為樣本,對MoS2/Au/4-MPB納米復(fù)合材料進(jìn)行考察。因?yàn)榉翘请牡母哓S度抑制,在富集前均不能檢測到糖肽(見圖6a);當(dāng)使用MoS2/Au/4-MPB功能納米材料富集后,非糖基化肽段消失,由圖6b和6c可以看出,當(dāng)物質(zhì)的量之比為1∶100和1∶1 000時(shí),分別鑒定出11個(gè)和3個(gè)N-糖肽,且無其他非糖肽峰出現(xiàn)。與之前報(bào)道的材料TCNBA[9]、AAPBA-硅膠雜化親和整體柱[27]相比,MoS2/Au/4-MPB在標(biāo)準(zhǔn)蛋白(IgG)胰蛋白酶酶切產(chǎn)物中具有更高的選擇性(100倍)。

MoS2/Au/4-MPB對于糖基化肽段的負(fù)載能力也是功能化納米復(fù)合材料的重要特性之一。實(shí)驗(yàn)分別將不同質(zhì)量的新型功能化納米材料與2 μg IgG胰蛋白酶酶切產(chǎn)物混合,富集洗脫后通過質(zhì)譜分析。在5次的重復(fù)試驗(yàn)中,選擇富集肽段中6條質(zhì)譜信號值強(qiáng)的肽段作為檢測指標(biāo),當(dāng)新型功能化納米材料的使用量為20 μg時(shí)選擇肽段質(zhì)譜峰信號強(qiáng)度達(dá)到最大值(見圖7)。此時(shí)經(jīng)過計(jì)算MoS2/Au/4-MPB對IgG胰蛋白酶酶切產(chǎn)物最大負(fù)載量約為100 μg/mg。負(fù)載量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明新型功能納米復(fù)合材料表面存在著大量的4-巰基苯硼酸活性基團(tuán),有利于對生物樣品中N-糖基化肽段的選擇性富集。

圖 8 尿液外泌體的(a)透射電鏡圖和(b)粒徑分布圖Fig. 8 (a) TEM image and (b) particle size distribution of urine exosomes

圖 7 MoS2/Au/4-MPB的質(zhì)量對IgG胰蛋白酶 消化物富集效果的影響(n=5)Fig. 7 Effect of quality of MoS2/Au/4-MPB on the enrichment effects of IgG trypsin digest (n=5)

2.3 MoS2/Au/4-MPB納米復(fù)合材料用于富集尿液外泌體蛋白酶切產(chǎn)物中的N-糖肽

外泌體是細(xì)胞分泌的具有雙層生物膜的囊泡,大小為30～150 nm[29],能運(yùn)載細(xì)胞內(nèi)的多種生物大分子,如脂類、microRNA、蛋白質(zhì)等[18,30,31]。越來越多的研究[32-35]證實(shí)外泌體可以作為許多疾病的潛在生物標(biāo)志物。但是目前有關(guān)尿液外泌體糖蛋白質(zhì)組的研究較少,為了進(jìn)一步考察納米復(fù)合材料在復(fù)雜生物樣本中對糖基化肽段的富集性能,實(shí)驗(yàn)選取了健康人尿液外泌體蛋白作為研究對象。與此同時(shí)為了驗(yàn)證使用超速離心所獲樣本為外泌體,將所獲樣本進(jìn)行了納米顆粒粒徑分析以及透射電鏡表征(見圖8),證明所獲樣本為尿液外泌體。

將1 mg新型功能納米材料與50 μg尿液外泌體蛋白質(zhì)提取物的胰蛋白酶酶切產(chǎn)物進(jìn)行混合富集,將富集所得的肽段樣本使用LC-MS/MS進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。在3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中分別從279、270、279個(gè)蛋白質(zhì)中鑒定到536、515、487個(gè)N-糖基化肽段,任意兩次至少鑒定出85%的N-糖基化肽段,將3次數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合后,一共鑒定到768個(gè)N-糖肽歸屬于377個(gè)N-糖蛋白。表明制備的新型功能化材料對生物樣本有很好的富集選擇性。上述結(jié)果表明,基于4-MPB的新型功能納米材料在糖基化蛋白組研究中有著巨大的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

利用超薄二維二硫化鉬納米材料作為固相基質(zhì)結(jié)合4-巰基苯硼酸發(fā)展了一種用于N-糖基化肽段富集的新型功能納米復(fù)合材料MoS2/Au/4-MPB。新型功能納米復(fù)合材料制備條件溫和,操作簡單。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新型功能納米材料對于低豐度N-糖基化肽段的分離與鑒定具有普適性。此外,將這種新型功能化納米材料應(yīng)用于尿液外泌體蛋白酶解產(chǎn)物中N-糖基化肽段的選擇性富集和質(zhì)譜分析,鑒定到了768種N-糖基化肽段，歸屬于377個(gè)N-糖蛋白,說明本工作發(fā)展的新型功能化納米材料在復(fù)雜生物樣品的糖基化蛋白質(zhì)組研究中具有很大應(yīng)用潛力。