王 建，邵 園，張印南，李 慧，朱 俊，許崇濤

（1.深圳市康寧醫(yī)院//深圳市精神衛(wèi)生中心，廣東 深圳 518000；2.汕頭大學精神衛(wèi)生中心，廣東 汕頭 515041）

睡眠剝奪是目前抗抑郁治療起效最快的方法之一[1]，但具體作用機制尚不明確。海馬作為皮質邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，與學習、情感、應激反應等腦功能有密切的聯(lián)系，抑郁癥的發(fā)生及抗抑郁治療機制方面的研究重點已經聚焦到了海馬。近年來有學者提出了抑郁癥的“神經營養(yǎng)因子假說”[2]，認為抑郁是由于海馬區(qū)神經營養(yǎng)因子水平降低導致神經元萎縮，海馬神經發(fā)生降低及膠質細胞缺失；而抗抑郁治療能夠阻斷或者反轉神經營養(yǎng)因子的缺失，進而反轉細胞的萎縮和缺失。膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF）作為神經營養(yǎng)因子中的重要一員，在海馬區(qū)高表達，對神經膠質細胞、多巴胺能、血清素能、去甲腎上腺素能神經元的生長和維護能產生廣泛的神經營養(yǎng)作用。有文獻[3]報道大鼠在慢性不可預知溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS） 后，海馬區(qū)GDNF的表達降低，而應用抗抑郁藥治療則會恢復GDNF的正常表達。故本研究選取海馬區(qū)GDNF作為研究點，首次在CUMS誘導的抑郁大鼠模型上，觀察快速眼動睡眠剝奪（rapid eye movement sleep deprivation，REMSD）對大鼠行為學及海馬區(qū)GDNF表達的影響，進一步探索睡眠剝奪快速抗抑郁效應的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

18只成年雄性SD大鼠由汕頭大學醫(yī)學院動物實驗中心提供，體質量220～300 g，SPF級。動物房通風良好，室溫控制在22℃，自然光照，自由進食、飲水。適應1周后正式開始實驗。

1.2 主要試劑

GDNF抗體（sc-328）購自美國Santa Cruz公司，β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒BeyoECL Plus均購自江蘇碧云天生物技術有限公司，RIPA Buffer（9806s）購自美國Cell Signaling公司，蛋白酶抑制劑（5892970001-1）購自瑞士Roche公司，BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Pierce公司，PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 實驗大鼠隨機分為正常對照組、應激造模組和REMSD組，每組6只。對所有大鼠進行首次開場實驗。然后應激組和REMSD組給予連續(xù)28 d CUMS，再對所有大鼠進行第2次開場實驗。隨后REMSD組進行連續(xù)72 h REMSD，最后對所有大鼠進行第3次開場實驗。斷頭取海馬，采用蛋白質印跡法檢測各組大鼠海馬區(qū)GDNF的表達。

1.3.2 CUMS模型制備 參照本研究組既往研究方法[4]，將禁食24 h、禁水24 h、夾尾1 min、行為束縛限制2 h、4℃冰水游泳5 min、明暗顛倒24 h、鼠籠傾斜45°24 h、潮濕墊料10 h、空瓶放置5 h、40℃高溫環(huán)境中振蕩10 min、電擊足底（電流強度1.0 mA，每次持續(xù)1 s，6次/min，共10 min）共11種刺激隨機安排到28 d內，每種刺激平均出現(xiàn)2～3次，同種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)，每日1種刺激，使大鼠不能預料刺激的發(fā)生。

1.3.3 REMSD模型建立 采用小平臺水環(huán)境法，選用長36 cm、寬32 cm、高30 cm的塑料水槽，其中放置1個直徑6.3 cm、高8.0 cm的平臺，在平臺周邊注滿水，水面距平臺面約1.0 cm，大鼠在平臺上可自行飲食、飲水，水溫保持在22℃左右。當大鼠進入快眼動睡眠時，由于全身肌張力降低，節(jié)律性地垂頭觸水或落入水中而覺醒，從而使大鼠始終不能進入快速眼動睡眠。

1.3.4 開場實驗 應用DigBehv動物自發(fā)活動行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)（上海移數信息科技有限公司）檢測，觀察箱長×寬×高為50 cm×50 cm×65 cm，房間隔音、隔光，15:00～17:00在黑暗的觀察箱內進行實驗，每只大鼠觀察時間5 min。動物的活動情況通過紅外攝像系統(tǒng)和視頻合成器，由計算機記錄大鼠的運動軌跡，分析總路程、中央區(qū)活動路程的改變。在應激前、應激后及72 h REMSD后共測定大鼠的自發(fā)活動3次。

1.3.5 蛋白質印跡法檢測大鼠海馬區(qū)GDNF的表達 取大鼠腦組織，加入RIPA裂解液，冰上研磨成勻漿，4℃、12 000 r/min離心5 min。BCA法測定蛋白含量。取100 μg總蛋白，5%～12%SDSPAGE電泳分離后轉移到PVDF膜，室溫封閉2 h后加入相應一抗，孵育過夜。然后再加入相應二抗，室溫孵育2 h。ECL化學發(fā)光顯影定影。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用EXCEL 2003和SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD（通過齊性檢驗）和非參數檢驗（未通過齊性檢驗），自身前后比較采用配對t檢驗，兩樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 應激和REMSD對大鼠開場實驗自發(fā)活動的影響

各組大鼠在應激前活動路程差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。應激后與正常對照組相比，應激造模組和REMSD組大鼠的總路程、中央路程均降低（P＜0.01），表明大鼠經過28 d CUMS后出現(xiàn)抑郁樣行為。REMSD組第3次開場實驗和第2次開場實驗相比，總路程、中央路程均增加（P＜0.01），表明REMSD改善了大鼠的抑郁樣狀態(tài)。見表1。

2.2 應激和REMSD對大鼠海馬區(qū)GDNF表達的影響

應激造模組大鼠海馬區(qū)GDNF表達水平較正常對照組降低（P＜0.01）；REMSD組大鼠海馬區(qū)GDNF表達水平較正常對照組降低（P＜0.05），但與應激造模組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

表1 大鼠自發(fā)活動開場實驗 （m，±s）

表1 大鼠自發(fā)活動開場實驗 （m，±s）

1）與正常對照組相比，P＜0.01；2）與REMSD組第2次實驗結果相比，P＜0.01；3）與應激造模組相比，P＜0.01。

組別正常對照組（n=6）應激造模組（n=6）REMSD組（n=6）第1次總路程20.80±1.62 20.49±1.81 20.97±1.44中央路程1.79±0.26 1.87±0.32 1.84±0.30第2次總路程19.44±2.48 5.32±1.541）5.12±1.721）中央路程1.79±0.31 0.54±0.281）0.55±0.211）第3次總路程21.01±2.02 5.18±1.431）21.24±1.902） 3）中央路程1.80±0.33 0.50±0.241）1.85±0.252） 3）

圖1 應激與REMSD對大鼠海馬區(qū)GDNF蛋白表達的影響

3 討論

CUMS被廣泛應用于抑郁癥的動物模型，其有效性可持續(xù)幾個月，具有較好的表面效度，符合抑郁模型的要求[5]。本研究應激組、REMSD組大鼠在CUMS 28 d后，自發(fā)活動開場實驗中總路程和中央路程較正常對照組均減少，表明大鼠應激后自發(fā)活動減少，出現(xiàn)抑郁樣行為。與抑郁癥患者的興趣下降、意志活動減退具有一定程度的相似性。本研究中CUMS在導致大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為的同時，能夠降低海馬區(qū)GDNF蛋白的表達，與Liu等[3]的研究一致。提示CUMS可能通過降低海馬區(qū)GDNF的表達導致大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，海馬區(qū)GDNF表達降低可能是抑郁癥的發(fā)生機制之一。已有文獻[6-7]報道抑郁癥病人外周GDNF的表達降低。最近有研究發(fā)現(xiàn)GDNF能夠通過誘導抗氧化物和降低氧化應激水平，對中樞神經系統(tǒng)起到保護作用[8]，而抑郁癥經常伴發(fā)神經炎癥及氧化應激水平的增高[9]。因此，我們推測GDNF的表達降低有可能是減少對神經的保護作用而在抑郁癥的發(fā)生機制中起重要作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，大鼠經過72 h REMSD后，其自發(fā)活動增加，提示REMSD可以改善大鼠的抑郁樣行為。這與既往研究結果是一致的，睡眠剝奪能夠快速改善抑郁癥患者的抑郁情緒，其在24 h內即可發(fā)揮抗抑郁效應[10]，而服用抗抑郁藥常需要2周甚至更長的時間才能起效。REMSD可以發(fā)揮快速抗抑郁作用，這為我們探索新的抑郁癥治療策略提供了一定方向。

本實驗并未發(fā)現(xiàn)REMSD 72 h對抑郁模型大鼠海馬區(qū)GDNF的表達有明顯影響，結合行為學結果提示GDNF本身可能并未參與REMSD快速抗抑郁的機制。既往文獻[11-12]報道在動物模型上應用抗抑郁藥，同樣對海馬區(qū)GDNF的表達無明顯影響。尸檢研究也發(fā)現(xiàn)服用抗抑郁藥對抑郁癥病人的海馬等多個腦區(qū)GDNF的表達無明顯影響[13]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)服用抗抑郁藥對血清GDNF水平無明顯影響[14]。Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)電休克治療對大鼠海馬區(qū)GDNF mRNA的表達無明顯影響，但增加了海馬區(qū)GDNF受體GFRα1和GFRα2 mRNA的表達，這提示GDNF受體的高表達可能是電休克治療抑郁癥的機制之一。本研究未檢測GDNF相關受體的表達變化，有可能其受體的表達變化在介導REMSD快速抗抑郁機制方面起重要作用。另外，抑郁癥患者不同腦區(qū)GDNF表達水平也可能存在差異[2]，我們的研究僅檢測了海馬區(qū)GDNF的變化，未來的研究應該繼續(xù)檢測額葉、紋狀體等腦區(qū)，通過對多腦區(qū)、多通路的研究來更好地探索睡眠剝奪快速抗抑郁的機制。

綜上所述，CUMS可能通過降低海馬區(qū)GDNF的表達導致大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，REMSD可以快速改善大鼠的抑郁樣行為，但GDNF本身可能并未參與其中快速抗抑郁的機制。