石 璇，李雙濤，吳 杰，高分飛

（汕頭大學醫(yī)學院 1.藥理學教研室，2.腦功能與疾病實驗室，廣東 汕頭 515041）

獲得特定腦區(qū)形態(tài)和活性良好的單個神經(jīng)細胞，是研究特定腦區(qū)神經(jīng)元生理功能和藥理特性的基本條件。雖然目前已經(jīng)能夠成功培養(yǎng)存活2周以上的原代神經(jīng)元細胞，但原代培養(yǎng)還只限于取材胚胎或新生幼仔的腦組織，這與成年神經(jīng)元細胞在生理功能和藥理特性上還是有一定不同；而且酶解分離培養(yǎng)需要大量的組織細胞，只取材特定腦區(qū)的組織，如海馬CA1區(qū)，獲得的細胞數(shù)太少；加上無菌條件下取材特定腦區(qū)組織的操作相對煩瑣，使得原代培養(yǎng)還無法完全取代急性分離方法。本研究探索建立一種小鼠特定腦區(qū)神經(jīng)元的急性振動分離方法，通過膜片鉗記錄技術(shù)對其進行電生理特性檢測，評估分離效果。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器

C57BL/6J小鼠，12～18 d，雌雄不限，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。

HEPES、Tris、兩性霉素B、葡糖酸鉀、瓊脂糖、谷氨酸、N-甲基-D-天冬氨酸（N-Methyl-D-aspartic acid，NMDA）、甘氨酸均購自美國Sigma-Aldrich公司，鏈霉蛋白酶購自德國Calbiochem公司，其余所用無機鹽均為市售分析純試劑。CompresstomeTMVF-200振動切片機購自美國Precisionary Instruments公司。膜片鉗系統(tǒng)組件包括：Axopatch 200B放大器、Digidata 1322A數(shù)字轉(zhuǎn)換器（美國MDC公司），IX71倒置顯微鏡（日本Olympus公司），MC1000e顯微操作器（美國SD公司），PP-830微電極拉制儀（日本Narishige公司）。HW-1000超級恒溫水浴購自成都泰盟軟件有限公司；WZ-II臺式真空泵購自上海之信儀器有限公司；自制針式振動細胞分離器，示意圖見圖1，將拉制的玻璃微電極尖端以火拋光成直徑0.1 mm左右的圓球形，固定于電磁繼電器的銜鐵上，通過方波刺激器控制振動頻率；自制U形管給藥系統(tǒng)。

圖1 振動分離神經(jīng)元裝置示意圖

1.2 溶液配制

分離液：蔗糖212.7 mmol/L，KCl 2.5 mmol/L，MgCl23 mmol/L，CaCl21 mmol/L，NaH2PO41.25 mmol/L，NaHCO326 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，室溫下通以95%（體積分數(shù)）O2和5%（體積分數(shù)）CO2混合氣飽和，pH 7.4。人工腦脊液：NaCl 124 mmol/L，KCl 5 mmol/L，NaH2PO41.25 mmol/L，NaHCO326 mmol/L，MgCl22 mmol/L，CaCl22 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，室溫下通以95%（體積分數(shù)）O2和5%（體積分數(shù)）CO2飽和，pH 7.4。標準液：NaCl 150 mmol/L、KCl 5 mmol/L、MgCl22 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L，用Tris滴定pH至7.4。膜片鉗實驗電極內(nèi)液：葡糖酸鉀150 mmol/L、MgCl28 mmol/L、HEPES 10 mmol/L，用Tris滴定pH至7.2。20 mg兩性霉素B溶于1 mL二甲基亞砜中配成母液，每10 μL分裝于0.5 mL EP管中避光冷凍備用。

1.3 海馬CA1區(qū)錐體細胞分離

小鼠經(jīng)異氟烷吸入麻醉，迅速開胸，左心室快速推注冰冷的分離液約10 mL，灌流腦組織。斷頭，剪開頭頂皮毛分兩邊，沿矢狀縫和人字縫剪開顱骨，將2片顱骨掀開，取腦放入冰冷的分離液中約1 min。用瓊脂糖包繞固定，在冰浴下用振動切片機沿冠狀面切成400 μm厚的腦片，轉(zhuǎn)移至持續(xù)通95%O2和5%CO2的人工腦脊液中，室溫下孵育1 h。將腦片轉(zhuǎn)移至加入鏈霉蛋白酶（1 mg/6 mL）的人工腦脊液中，根據(jù)鼠齡在31℃酶解20～40 min，酶解過程中持續(xù)通入95%O2和5%CO2。酶解結(jié)束將腦片轉(zhuǎn)移至人工腦脊液中，穩(wěn)定20 min左右。將腦片轉(zhuǎn)移至盛有氧飽和標準液的35 mm培養(yǎng)皿中，以U型網(wǎng)狀腦片固定小配件（美國Warner Instruments公司）壓住腦片防止移動，在倒置顯微鏡低倍鏡下找到海馬CA1區(qū)，將玻璃針頭置于其上，以方波刺激器控制振動頻率為4～5 Hz，水平振動幅度大約1 mm，逐漸下壓振動海馬CA1區(qū)組織，使組織松散，神經(jīng)元細胞脫逸出來。最后取出腦片，讓分離出的神經(jīng)元細胞靜置10 min左右貼壁，即可用于膜片鉗實驗。

1.4 穿孔膜片鉗記錄

選擇胞體較大、細胞輪廓清晰、軸突較粗和長的神經(jīng)元置于倒置顯微鏡工作臺中央，用標準液作為細胞外液灌流，貼壁牢固者為佳。玻璃微電極（G-1.5，日本Narishige公司）由拉制儀分兩步拉制而成，電極電阻通常為5～6 MΩ；將電極尖端浸入電極內(nèi)液中，利用毛細現(xiàn)象使電極尖端先吸入一些電極內(nèi)液，再反向充灌含400 μg/mL兩性霉素B的電極內(nèi)液。調(diào)節(jié)微操縱器使電極尖端輕輕壓上細胞后，施加少許負壓，形成吉歐封接。等待兩性霉素B慢慢打孔，形成穿孔全細胞模式。

2 結(jié)果

2.1 急性分離小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)

相差顯微鏡下觀察分離的海馬神經(jīng)元，狀態(tài)和活性好的細胞一般保留基本形態(tài)特征，包括胞體、樹突和軸突，胞體呈錐形或三角形，整個細胞胞膜清晰、胞體透亮、胞漿均勻一致，并保存有較長的軸突、樹突，立體感較強，貼壁好（圖2）。若細胞損傷較嚴重或死亡，則胞膜模糊，突起斷裂或呈串珠狀，胞漿有明顯的黑色顆粒。

圖2 急性分離C57BL/6J小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元

2.2 小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元電生理特性

分離的小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞易于形成高阻封接，電極尖端接觸細胞后給予很小負壓即可形成高阻封接?；钚粤己玫腻F體細胞常有自發(fā)的動作電位發(fā)生，兩性霉素B穿孔后，在電流鉗制模式下即可觀察到自發(fā)和誘發(fā)的動作電位（圖3）。細胞的活性與細胞的靜息膜電位相關(guān)，活性好的細胞靜息電位均在-50 mV以上（由于未作串聯(lián)電阻和漏電流補償，與真實值有一定差異）；活性差的細胞靜息電位值低，自發(fā)動作電位少，低于-40 mV即使給予電流刺激也誘發(fā)不出動作電位。

圖3 電流鉗模式下小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞自發(fā)和誘發(fā)的動作電位

在電壓鉗模式下，鉗制電位為-20 mV，以步階為10 mV復極化到-50～-30 mV，脈沖寬度為1 s，可記錄到復極化的電壓依賴性鉀電流M，見圖4。

圖4 小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞的M電流

在電壓鉗模式下，鉗制電位=-50 mV，U形管快速給藥系統(tǒng)管口距細胞約100 μm，將含1 mmol/L谷氨酸的標準液，加于錐體細胞周圍1 ms，然后迅速沖走，可記錄到谷氨酸受體依賴性離子通道內(nèi)向電流；若將含100 μmol/L NMDA和3 μmol/L甘氨酸的標準液，加于錐體細胞周圍1 ms，可記錄到NMDA受體依賴性離子通道內(nèi)向電流（圖5）。

圖5 小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞的谷氨酸和NMDA受體依賴性離子通道電流

3 討論

腦組織神經(jīng)元細胞的傳統(tǒng)分離方法是腦組織切片后酶解，然后分離特定腦區(qū)的組織，用管口口徑從粗到細的吸管逐級吹打，得到單個分離的細胞[1-2]。本文中所用分離方法的原理和傳統(tǒng)分離方法相似，在腦組織酶解松散以后，用機械吹打或振動的形式，使細胞脫離下來。但吹打的分離方法常用于大鼠的腦組織，因為小鼠等小動物的某些核團或功能區(qū)太小，解剖鏡下選取不易準確定位，分離時易連帶其他腦區(qū)組織。而玻璃微電極尖端細小，振動幅度才1 mm左右，在40倍鏡下選取腦區(qū)較精準。我們的實驗結(jié)果顯示，分離的神經(jīng)元不僅形態(tài)特征保持較完整，而且不需要多聚賴氨酸涂層，分離的神經(jīng)元也能穩(wěn)定貼壁于清潔培養(yǎng)皿。并且分離的神經(jīng)元還保持了良好的電生理活性。Akaike等[3]發(fā)現(xiàn)酶消化易破壞神經(jīng)元細胞膜上的NMDA受體通道，而本法可記錄到這類受體通道電流。當技術(shù)掌握純熟的時候，對于幼齡的腦組織，還可以不經(jīng)過酶消化，直接在腦片上振動分離得到細胞。這種純機械分離的神經(jīng)細胞胞體上還帶有許多突觸前膜[4]，可以檢測反映細胞間突觸聯(lián)系的突觸后電流。

理論上，腦片越薄越有利于氧和養(yǎng)分的滲入，使得神經(jīng)細胞活性保持越長久。但一般認為，腦片切面100 μm內(nèi)的細胞是受損的，故而刨除上下2個切面附近的受損細胞，腦片厚度至少要大于200 μm。對于腦片膜片鉗實驗，只要腦片內(nèi)有少量的活性細胞就可以滿足實驗的需要，所以腦片厚度一般切250 μm即可；而對于分離單個神經(jīng)細胞，在機械分離過程中又會損傷絕大多數(shù)細胞，腦片中必須有較大數(shù)量的活性細胞才能保證小概率下獲得幾個形態(tài)和活性良好的細胞，綜合兩方面因素，分離神經(jīng)細胞的腦片厚度以400 μm為宜[5]。

小鼠海馬CA1區(qū)腦組織對缺氧敏感，在孵育及酶處理過程中必須連續(xù)不斷地供給氧氣。通氣時要注意防止腦片隨氣泡翻動。從我們的經(jīng)驗來看，小鼠海馬CA1區(qū)腹側(cè)腦組織比背側(cè)更強壯，同樣條件下，腹側(cè)分離的好細胞要更多些。分離下來的神經(jīng)細胞，活性隨著時間延長下降較快，大概3 h后，活性普遍明顯下降。故而實驗過程中，首先要挑選細胞形態(tài)最好的培養(yǎng)皿中的最好的細胞進行實驗，以免按分離順序進行下來，每個細胞活性都不是最好，每個結(jié)果都不太理想。

綜上所述，急性振動分離法分離的神經(jīng)元不僅具有較好的電生理活性，而且可以較精準地分離特定腦區(qū)的神經(jīng)元，是研究特定腦區(qū)單個神經(jīng)元生理功能和藥理特性的一種好方法。