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        利用廢煙末發(fā)酵制備細(xì)菌纖維素

        2020-07-26 08:49:34張婷婷馮穎杰楊宗燦文秋成王高杰馬勝濤李懷奇
        食品與機械 2020年6期
        關(guān)鍵詞:提取液纖維素培養(yǎng)基

        張婷婷 馮穎杰 楊宗燦 文秋成 王高杰 馬勝濤 李懷奇 張 展

        (河南中煙煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,河南 鄭州 450000)

        中國每年煙葉產(chǎn)量 450萬~500萬t,且在煙草種植和加工過程中產(chǎn)生的低次煙葉、莖稈、杈煙等煙草廢棄物可達(dá)煙葉總產(chǎn)量的25%[1]。目前國內(nèi)外對廢、次煙葉產(chǎn)品的綜合利用主要是從中提取茄尼醇、煙堿和蛋白質(zhì)等,也有用于制作有機肥料及雞飼料,但其大部分被作為廢物丟棄或焚燒,造成了自然資源的浪費和極大的環(huán)境污染[2]。

        細(xì)菌纖維素(BC)具有與植物纖維素相似的化學(xué)成分,卻具有更高的純度、持水性、聚合度、結(jié)晶度,以及更良好的生物相容性和更高機械強度[3]?;讵毺氐膬?yōu)良性質(zhì),細(xì)菌纖維素作為一種新型納米生物材料受到科學(xué)和工業(yè)界的廣泛關(guān)注,并在食品工業(yè)、生物醫(yī)學(xué)、造紙、聲學(xué)器材、紡織等多個領(lǐng)域得到廣泛研究和應(yīng)用[4-5]。

        細(xì)菌纖維素生產(chǎn)中,培養(yǎng)基原料的成本偏高尤其是碳源的成本偏高,制約了細(xì)菌纖維素的大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化進(jìn)程。近年來,各種工業(yè)副產(chǎn)品和農(nóng)林業(yè)廢物已被用作碳源以提高產(chǎn)量和減少BC生產(chǎn)的成本。截至目前,已有幾種原料廢料被證實是BC生產(chǎn)的潛在基質(zhì),如果汁、玉米秸稈、飲料工業(yè)廢棄物、玉米芯酸水解物和廢啤酒酵母[5-7]。煙草中富含糖、氨基酸、無機鹽等組分,可作為發(fā)酵底物,但利用煙草廢料發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素尚未見報道。

        試驗擬研究利用煙草廢料提取液發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的可行性,探索煙草廢料利用,旨在為BC生物材料生產(chǎn)提供有效碳源,同時為拓展煙草廢棄物的綜合利用提供一條全新的途徑。

        1 材料與方法

        1.1 材料、試劑和儀器

        1.1.1 材料與試劑

        廢棄煙末:收集自河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司卷煙廠除塵車間;

        發(fā)酵菌種:木醋桿菌,實驗室保藏;

        酵母粉、蛋白胨:美國OXOID公司;

        淀粉酶:4 000 U/g,無錫杰能科生物工程有限公司;

        葡萄糖、磷酸氫二鈉、檸檬酸、硫酸、氫氧化鈉:分析純,中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

        1.1.2 主要儀器設(shè)備

        恒溫恒濕培養(yǎng)箱:Forma3913型,賽默飛世爾科技公司;

        連續(xù)流動分析儀:AutoAnalyzer3型,德國Seal公司;

        射線衍射儀:XRD-6100型,日本島津制作所;

        傅立葉變換紅外光譜儀:VERTEX70型,德國布魯克儀器公司;

        透射電鏡:JEM-1011型,日本電子株式會社。

        1.2 方法

        1.2.1 煙末浸提液及HS培養(yǎng)基制備

        (1) HS液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨5 g/L、磷酸氫二鈉4 g/L、一水合檸檬酸1.2 g/L,120 ℃滅菌10 min。

        (2) 煙末浸提液培養(yǎng)基:煙末100 g/L,在70 ℃條件下浸提100 min后過濾,保留濾液,120 ℃滅菌10 min。

        (3) 煙末浸提液酶解處理培養(yǎng)基:煙末100 g/L,淀粉酶200 U/mL,在50 ℃條件下浸提100 min后過濾,保留濾液,120 ℃滅菌10 min。

        (4) 煙末浸提液酸解處理培養(yǎng)基:煙末100 g/L,硫酸1 mol/L,在70 ℃條件下浸提100 min后過濾,保留濾液,120 ℃滅菌10 min。

        1.2.2 煙末浸提液常規(guī)組分測定 取2 mL浸提液,加入1 mL乙酸和17 mL蒸餾水,100 r/min震蕩40 min,過濾后進(jìn)行分析。

        (1) 水溶性糖:按YC/T 159—2002執(zhí)行。

        (2) 總氮(不包括硝態(tài)氮):按YC/T 161—2002執(zhí)行。

        (3) 總植物堿(以煙堿計):按YC/T 160—2002執(zhí)行。

        (4) 氯:按YC/T 162—2002執(zhí)行。

        1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化 從菌種斜面上,用接種環(huán)挑取菌落,接種至HS液體培養(yǎng)基中,在30 ℃恒溫條件下,以120 r/min震蕩培養(yǎng)24 h,得到種子液。利用煙末浸提液作為培養(yǎng)基,對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,單因素試驗設(shè)計:

        (1) 發(fā)酵溫度:在初始pH值5,接種4%,發(fā)酵時間7 d的條件下,考察發(fā)酵溫度(20,25,30,35,40 ℃)對細(xì)菌纖維素膜產(chǎn)量的影響。

        (2) 發(fā)酵時間:在初始pH值5,接種4%,發(fā)酵溫度30 ℃條件下,考察發(fā)酵時間(4,7,8,9,10 d)對細(xì)菌纖維素膜產(chǎn)量的影響。

        (3) 接種量:在初始pH值5,發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵時間7 d的條件下,考察接種量(4%,6%,8%,10%,15%)對細(xì)菌纖維素膜產(chǎn)量的影響。

        (4) pH值:在接種4%,發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵時間 7 d 的條件下,考察發(fā)酵初始pH值(4.5,5.0,5.5,6.0,6.5)對細(xì)菌纖維素膜產(chǎn)量的影響。

        1.2.4 細(xì)菌纖維素物理表征

        (1) 掃描電鏡觀察:冷凍干燥后的BC膜粘于導(dǎo)電膠上,置于真空鍍膜機中進(jìn)行表面噴金1 min,放入掃描電鏡中觀察并拍照,觀察電壓為5 kV。

        (2) 紅外光譜分析:采用KBr 壓片進(jìn)行紅外光譜表征,分辨率為4 cm-1,掃描范圍為400~4 000 cm-1。

        (3) X射線衍射分析:Cu靶,40 kV高壓,管流為40 mA,2θ為 10°~80°掃描,得到 XRD光譜,采用Jade軟件分析處理數(shù)據(jù)。

        1.2.5 BC產(chǎn)量和持水性計算 根據(jù)文獻(xiàn)[8]修改如下:將發(fā)酵獲得的BC膜撈出,用0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡,沸水浴中煮1 h,然后用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性。將洗滌后經(jīng)4 000 r/min離心20 min的細(xì)菌纖維素膜定義為濕膜,將105 ℃下烘干至恒重的細(xì)菌纖維素膜定義為干膜,將干膜于常溫水中浸泡48 h后用濾紙吸干表面水分,所得膜定義為復(fù)水膜。分別按(1)~(3)計算BC的產(chǎn)量、含水率和復(fù)水率。

        (1)

        (2)

        (3)

        式中:

        R——細(xì)菌纖維素產(chǎn)量,g/L;

        c1——濕膜含水率,%;

        c2——干膜復(fù)水率,%;

        V——發(fā)酵液體積,L;

        Mw——濕膜的質(zhì)量,g;

        Md——干膜的質(zhì)量,g;

        Mwr——復(fù)水膜的質(zhì)量,g。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 不同煙末浸提處理方法比較

        如圖1所示,直接采用水提處理的煙末浸提液培養(yǎng)基時,BC可以有效生長,產(chǎn)量約達(dá)1.6 g/L。采用淀粉酶酶解處理煙末制得的浸提液培養(yǎng)中還原糖和總糖濃度略有增加,BC產(chǎn)量也提高至1.7 g/L。采用稀硫酸水解煙末制備的浸提液培養(yǎng)基中糖濃度最高,但是BC的生長完全被抑制。這可能是由于浸提液的pH偏低,不利于微生物的生長。但采用NaOH將浸提液pH調(diào)節(jié)至5左右時,BC產(chǎn)量僅為1.0 g/L。文獻(xiàn)[9]報道,酸解過程中可能會增加糠醛類等抑制微生物活性的組分,從而給BC的生長帶來不利影響??傮w比較認(rèn)為,酶處理或酸解處理流程更復(fù)雜,成本更高,且對BC產(chǎn)量沒有顯著的促進(jìn)作用。因此,煙末直接水提作為BC生產(chǎn)的培養(yǎng)基是最佳選擇。

        圖1 不同煙末浸提法細(xì)菌纖維素產(chǎn)量

        2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

        采用煙末直接水提的浸提液做培養(yǎng)基,考察了接種量、溫度、pH、發(fā)酵時間等條件對BC產(chǎn)量的影響,如圖2所示。由圖2可知:

        圖2 BC發(fā)酵條件優(yōu)化

        (1) 發(fā)酵溫度由20 ℃升高至30 ℃時,BC產(chǎn)量顯著提高。當(dāng)溫度進(jìn)一步升高至35 ℃時,BC產(chǎn)量下降,在40 ℃菌體幾乎沒有細(xì)菌纖維素的生成,微生物的生長需要依靠酶將蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)進(jìn)行分解而后被細(xì)胞利用,當(dāng)溫度過低或過高時都會影響酶的活性,造成細(xì)菌纖維素產(chǎn)量下降,結(jié)果表明30 ℃最適合菌體生長和代謝產(chǎn)物生成,是最佳發(fā)酵溫度。

        (2) BC產(chǎn)量在0~7 d內(nèi)隨著發(fā)酵時間的延長迅速增長,7~10 d BC產(chǎn)量增長緩慢。這可能由于發(fā)酵初期碳源、氮源等營養(yǎng)充足,菌體生長較快,隨著發(fā)酵時間的延長,碳源、氮源等大量消耗且葡萄糖酸、乙酸等代謝副產(chǎn)物積累,發(fā)酵液的pH下降,抑制了BC的合成。因此,最佳發(fā)酵時間以7 d為宜。

        (3) 隨著接種量的增加,BC產(chǎn)量逐漸增加,當(dāng)接種量超過6%后,BC產(chǎn)量增加幅度趨緩。提高接種量或許可以縮短延遲期,加快菌體生長,使產(chǎn)物形成期提前,但是如果接種量過多,也會導(dǎo)致底物前期消耗過快,不利于后期產(chǎn)物積累。而且在接種量較高的情況下,由于菌體濃度過大,可能導(dǎo)致代謝產(chǎn)酸過多,發(fā)酵液中的溶氧減少,反而影響B(tài)C的合成[10]。因此,最佳接種量選定為6%。

        (4) 初始pH值為5時BC產(chǎn)量最高,當(dāng)pH過高或過低時,BC產(chǎn)量都會下降,因此最佳發(fā)酵初始pH值為5。

        綜上所述,利用煙末廢料水提液作為培養(yǎng)基,利用木醋桿菌進(jìn)行發(fā)酵,最優(yōu)發(fā)酵條件為接種量6%,初始pH 5,溫度30 ℃,發(fā)酵時間7 d。

        2.3 重復(fù)發(fā)酵驗證

        為了驗證菌株對原料的適應(yīng)性和發(fā)酵穩(wěn)定性,選取不同批次的廢棄煙末開展了重復(fù)發(fā)酵驗證試驗,參照文獻(xiàn)[11],在煙末與水比例1∶10 (g/mL),溫度70 ℃條件下,對煙末水提60 min,煙末提取液常規(guī)組分如表1所示,提取液中還原糖、總糖、總氮等各項組分濃度高低與煙末原料表現(xiàn)一致,F(xiàn)號煙末提取液總糖和還原糖含量最高(分別為18.15,16.28 mg/mL),A號煙末提取液總糖和還原糖含量最低(分別為9.46,8.72 mg/mL),6種煙末總堿、總氮、氯等組分則含量較為接近。

        按照2.2優(yōu)化的工藝條件,以6種煙末提取液為培養(yǎng)基在30 ℃條件下、接種6%、發(fā)酵7 d,以HS培養(yǎng)基為對照,細(xì)菌纖維素產(chǎn)量如圖3所示,BC產(chǎn)量為1.8~2.5 g/L。從圖3可以看出,6種煙末糖濃度高低與發(fā)酵產(chǎn)生的BC產(chǎn)量表現(xiàn)一致,F(xiàn)號煙末提取液發(fā)酵的BC產(chǎn)量最高,接近HS培養(yǎng)基BC產(chǎn)量,說明煙末提取液能夠滿足菌體生長,是發(fā)酵產(chǎn)生細(xì)菌纖維素的良好底物。

        表1 6種煙末提取液常規(guī)組分

        圖3 煙末水提取液糖濃度與細(xì)菌纖維素產(chǎn)量關(guān)系

        2.4 細(xì)菌纖維素表征

        由圖4可知,以煙末提取液作為培養(yǎng)基產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素?fù)碛忻芗慕豢棾?xì)纖維網(wǎng)絡(luò),其直徑遠(yuǎn)小于天然纖維素,與前人[12]研究的使用其他原始廢料產(chǎn)生細(xì)菌纖維素的觀察結(jié)果相似。與HS培養(yǎng)基相比,煙末培養(yǎng)基產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素有密度較大的網(wǎng)絡(luò)和較小的原纖維寬度,以及更為光滑的纖維表面。

        圖4 細(xì)菌纖維素掃描電鏡圖

        圖5 細(xì)菌纖維素XRD圖

        如圖6所示,來自HS培養(yǎng)基、煙末提取液的細(xì)菌纖維素樣品同購買所得樣品一樣具有纖維素的特征峰。區(qū)分峰值3 340 cm-1表示O—H拉伸,2 900 cm-1表示C—H伸縮,1 645 cm-1表示C—O—C拉伸,1 064 cm-1表示C—O拉伸和900 cm-1表示平面內(nèi)的γ(COC),對稱拉伸,Jahan等[14]已經(jīng)報道了類似的研究結(jié)果。從HS培養(yǎng)基和煙末提取液獲得的細(xì)菌纖維素未見明顯區(qū)別,表明培養(yǎng)介質(zhì)對BC功能團(tuán)沒有影響。

        圖6 細(xì)菌纖維素紅外光譜圖

        如表2所示,從煙草提取液中獲得的細(xì)菌纖維素膜含水率為97.9%,略低于HS培養(yǎng)基中的細(xì)菌纖維素膜,兩種細(xì)菌纖維素膜的復(fù)水率相似,分別為67.5%,67.9%,兩種培養(yǎng)基中獲得的膜持水性相似。

        表2 細(xì)菌纖維素含水率和復(fù)水率

        綜上所述,煙末發(fā)酵制備的BC與對照樣品(HS培養(yǎng)基)相比,在形貌結(jié)構(gòu),物理性能上均無顯著差異。

        3 結(jié)論

        結(jié)果表明,煙末水浸提液可直接作為發(fā)酵原料生產(chǎn)細(xì)菌纖維素,無需額外添加碳源氮源;以煙末水浸提液為原料,發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素的最優(yōu)工藝為接種量6%,初始pH為5,溫度30 ℃,發(fā)酵時間7 d;不同批次的廢棄煙末發(fā)酵驗證表明,細(xì)菌纖維素產(chǎn)量隨原料中糖含量的增加而增加,產(chǎn)量在1.8~2.5 g/L,與HS培養(yǎng)基相當(dāng);煙末發(fā)酵制備的細(xì)菌纖維素與對照樣品(HS培養(yǎng)基)相比,在形貌結(jié)構(gòu)上無顯著差異。綜上所述,利用煙草廢棄物發(fā)酵制備細(xì)菌纖維素具有可行性。

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