吳民富 李 莎 徐振林 孫遠(yuǎn)明

(1. 佛山職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)系，廣東 佛山 528137；2. 廣東省食品安全檢測(cè)與溯源技術(shù)應(yīng)用公共實(shí)訓(xùn)中心，廣東 佛山 528137；3. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；4. 廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

研究擬利用導(dǎo)電性和生物相容性良好的納米材料構(gòu)建傳感器，采用直接競(jìng)爭(zhēng)法對(duì)待測(cè)物進(jìn)行分析。在電極基底分別修飾二氧化錫/碳化硅空心球納米鏈(SnO2/SiC NCs)、苯胺納米線和金納米顆粒(GNPs)，抗體探針采用膠體金作為載體，提高檢測(cè)靈敏度。該傳感器快速、檢測(cè)限低、特異性強(qiáng)、檢測(cè)過(guò)程操作簡(jiǎn)便，可應(yīng)用于食用油中黃曲霉毒素B1的快速檢測(cè)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

氯金酸：≥99%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

黃曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFM1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、伏馬毒素B1(FB1)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)：≥96%，北京百靈威科技有限公司；

苯胺、殼聚糖：分析純，上海阿拉丁試劑有限公司；

黃曲霉毒素B1抗體：山東綠都生物科技有限公司；

黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)試劑盒：深圳芬德生物技術(shù)有限公司；

漸漸地，偉翔變得很沉默了。沒(méi)有什么朋友，也很少出去應(yīng)酬，下班回來(lái)，除了做家務(wù)，跟糖果玩，就是把自己關(guān)在書(shū)房里。陰沉個(gè)臉，像誰(shuí)欠他八百吊。我更加生氣，我累死累活，他倒給我臉色看。

電化學(xué)工作站：CHI660D型，上海辰華儀器有限公司；

透射電子顯微鏡：TECNAI12型，荷蘭FEI電子光學(xué)有限公司；

掃描電子顯微鏡：Ultra 55型, 德國(guó)卡爾蔡司公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV1800型，島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司。

1.2 二氧化錫/碳化硅空心球納米鏈(SnO2/SiC NCs)的合成

首先合成SnO2@C納米鏈：0.142 g錫酸鈉和2.73 gD-葡萄糖溶于17.5 mL去離子水，轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯反應(yīng)釜，180 ℃恒溫加熱4 h，產(chǎn)物離心后用去離子水和乙醇沖洗，烘干。氬氣保護(hù)下置于管式爐中700 ℃ 2 h。合成的SnO2@C納米鏈作為前驅(qū)體，加入過(guò)量硅粉充分混勻。然后置于管式爐中央，在氬氣環(huán)境中以3 ℃/min的速率加熱到1 320 ℃，保持4 h。產(chǎn)物用硝酸∶氫氟酸3∶1溶液處理12 h，除去過(guò)量的硅，100 ℃烘干備用[18]。

1.3 金納米顆粒(GNPs)的制備

采用檸檬酸三鈉還原法。100 mL 0.01%的四氯金酸水溶液置于圓底燒瓶，電熱套加熱至沸騰。持續(xù)攪拌下迅速加入2 mL 1%的檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)攪拌加熱3 min，直至溶液呈現(xiàn)透亮的紅色。室溫下冷卻，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 辣根過(guò)氧化物酶—金納米顆?！贵w(HRP-GNPs-Ab)的制備

取上述制備的GNPs 500 μL，用0.1 mol/L的碳酸鉀溶液將pH調(diào)至9.6。加入1 mL 20 μg/mL的黃曲霉毒素B1抗體和1 mL 0.5 mg/mL的HRP，旋渦混勻30 min后用1 mL 5%的BSA溶液封閉1 h，12 000 r/min 4 ℃離心30 min，沉淀用1 mL 0.01 mol/L pH 7.4的PBS反復(fù)洗滌。產(chǎn)物分散于1 mL 0.01 mol/L pH 7.4 的PBS中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 修飾電極的制備與檢測(cè)

直徑為3 mm的玻碳電極(GCE)先后在含1.00，0.30，0.05 μm Al2O3粉末的麂皮上拋光至鏡面，用50%的HNO3水溶液、無(wú)水乙醇和去離子水分別超聲清洗電極表面，氮?dú)獯蹈蓚溆?。? mg SnO2/SiC NCs超聲分散在1 mL去離子水中，取200 μL分散好的SnO2/SiC NCs加入100 μL 0.1% 的殼聚糖(CS)醋酸溶液，斡旋震蕩混勻。取5 μL SnO2/SiC NCs/CS滴加到預(yù)處理好的玻碳電極表面，37 ℃烘箱中烘干。上述電極置于6 mL含0.5 mmol苯胺的H2SO4溶液(0.5 mol/L)中，采用三電極系統(tǒng)(玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對(duì)電極)在0.0～1.0 V的電位區(qū)間循環(huán)伏安法(CV)掃描16段，使電極表面生成聚苯胺納米線(PANINW)。去離子水沖洗電極表面，氮?dú)獯蹈伞Ｉ鲜鲭姌O置于經(jīng)N2除氧10 min的含2 mmol/L氯金酸的H2SO4溶液(0.5 mol/L)中，采用三電極系統(tǒng)在-0.1～0.2 V的電位區(qū)間CV掃描12段，去離子水沖洗電極表面，氮?dú)獯蹈?。上述電極滴加5 μL一定濃度的包被原，37 ℃孵育3 h。未吸附的包被原用0.01 mol/L pH 7.4的PBST沖洗，氮?dú)獯蹈珊笥? μL 10%的BSA溶液孵育1.5 h封閉未結(jié)合位點(diǎn)，防止非特異性吸附。用0.01 mol/L pH 7.4的PBST沖洗電極，置于4 ℃冰箱中備用。

1.6 電化學(xué)檢測(cè)

2.5 μL不同濃度的AFB1和2.5 μL HRP-GNPs-Ab探針先后滴加到上述修飾電極，37 ℃孵育1 h后用PBST沖洗。修飾電極與鉑電極、飽和甘汞電極組成三電極體系，置于6 mL 1 mmol/L的對(duì)苯二酚緩沖液，在-0.6～0.8 V范圍進(jìn)行循環(huán)伏安法(CV)掃描。電化學(xué)工作站記錄加入25 μL 0.48 mol/L H2O2前后的CV曲線。

1.7 樣品處理

2 g待測(cè)食用油置于15 mL離心管，加入2 mL正己烷和4 mL甲醇。漩渦震蕩提取5 min，6 000 r/min離心5 min，取1 mL下層甲醇溶液加4 mL去離子水混勻待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)原理

所制備的直接競(jìng)爭(zhēng)免疫傳感器檢測(cè)原理如圖1所示，首先在玻碳電極表面修飾具有良好導(dǎo)電性和生物相容性的殼聚糖、SnO2/SiC NCs、聚苯胺納米線(PANINW)和金納米顆粒(GNPs)，利用Au—S鍵固定包被原，卵清蛋白(OVA)封閉未結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)加入HRP-GNPs-Ab和待測(cè)物，采用競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)模式，電極上的納米金標(biāo)記探針HRP-GNPs-Ab的固定量與待測(cè)物濃度呈反比，納米金標(biāo)記探針上的HRP酶催化對(duì)苯二酚(HQ)和過(guò)氧化氫產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，通過(guò)電化學(xué)工作站記錄。根據(jù)電化學(xué)信號(hào)與待測(cè)物濃度的關(guān)系建立檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 免疫傳感器的檢測(cè)原理

碳化硅(SiC)、二氧化錫(SnO2)和聚苯胺等納米材料各具優(yōu)點(diǎn)，在傳感器中具有良好的應(yīng)用前景。SiC納米材料具有加速電子和質(zhì)子傳遞的作用，并且具有良好的穩(wěn)定性[19-20]；二氧化錫納米材料具有比表面積大、易于功能化和良好的電子傳導(dǎo)性能[21]，SnO2/SiC NCs作為新型納米復(fù)合材料，兼具SnO2和SiC的優(yōu)點(diǎn)，目前未有SnO2/SiC NCs納米復(fù)合物在黃曲霉毒素檢測(cè)中應(yīng)用的報(bào)道。聚苯胺具有良好的生物相容性和導(dǎo)電性，是生物分子的良好受體[22]。通過(guò)納米材料的應(yīng)用，可提高生物分子的固載，加快電極表面的電子傳遞速率，提升檢測(cè)靈敏度。

2.2 二氧化錫/碳化硅空心球納米鏈的表征

采用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡對(duì)所制備的SnO2/SiC空心球納米鏈(SnO2/SiC NCs)進(jìn)行表征，由圖2可知，SnO2/SiC NCs呈均一的空心簇狀球形結(jié)構(gòu)，直徑約為80 nm，呈現(xiàn)出立體結(jié)構(gòu)。SnO2/SiC NCs的三維結(jié)構(gòu)使得電極的有效面積大大增加，粗糙的表面有利于苯胺的沉積，更好地固定包被原。

圖2 SnO2/SiC空心球納米鏈的掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡

2.3 HRP-GNPs-Ab的表征

HRP-GNPs-Ab復(fù)合物的紫外—可見(jiàn)光譜如圖3所示，HRP酶在405 nm處有吸收峰，抗體在280 nm處有吸收峰，金納米顆粒在514 nm處有強(qiáng)吸收峰，所制備的HRP-GNPs-Ab吸收峰分別在275，405，536 nm，表明HRP和抗體成功地偶聯(lián)在金納米顆粒上[23]。

圖3 HRP、Ab、GNPs和HRP-GNPs-Ab的紫外—可見(jiàn)光譜圖

2.4 電極組裝過(guò)程的表征

a. GCE b. SnO2-SiC NCs/CS/GCE c. PANINW/SnO2-SiC NCs/CS/GCE d. GNPs/PANINW/SnO2-SiC NCs/CS/GCE e. Antigen/GNPs/PANINW/SnO2-SiC NCs/CS/GCE

2.5 納米傳感器的信號(hào)放大

傳感器通過(guò)待測(cè)物濃度與電化學(xué)信號(hào)的關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。二者在一定的條件下呈正相關(guān)關(guān)系[25]。因此，通過(guò)增加反應(yīng)轉(zhuǎn)移的電子數(shù)及增大電極表面的有效面積，可增加響應(yīng)電流，提高檢測(cè)的靈敏度。

試驗(yàn)采用納米材料在基底和探針雙重放大信號(hào)策略進(jìn)行信號(hào)放大。通過(guò)金標(biāo)記抗體探針上的HRP酶催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生信號(hào)，以對(duì)苯二酚(HQ)作為電子轉(zhuǎn)移中介體，研究傳感器在HQ溶液中的電化學(xué)行為。GNPs/PANINW/SnO2-SiC NCs/CS作為基底修飾材料，多層納米材料具有優(yōu)良的生物相容性、導(dǎo)電性及大比表面積，作為基底材料可以更好地固定生物分子，提高電流響應(yīng)速度。GNPs用于標(biāo)記探針有利于增加單位抗體上HRP酶的固載量，放大電流信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度。為驗(yàn)證納米材料對(duì)傳感器信號(hào)的提升作用，對(duì)比不同基底修飾和探針對(duì)信號(hào)的影響，研究不同修飾的電極在含1 mmol/L HQ 的pH 7.4 PBS中的電化學(xué)行為。采用直接沉積金和單標(biāo)記抗體時(shí)，電流變化值為14.8 μA[圖5(a)]；先后加入SnO2-SiC NCs和聚苯胺納米線后，電流變化值分別增大至21.6 μA[圖5(b)]和24.1 μA[圖5(c)]；采用HRP-GNPs-Ab探針后，電流變化值增大為32.9 μA[圖5(d)]，說(shuō)明納米材料放大了電化學(xué)信號(hào)，有利于提高反應(yīng)的靈敏度。

虛線為未添加過(guò)氧化氫的循環(huán)伏安曲線，實(shí)線為添加25 μL過(guò)氧化氫后的循環(huán)伏安曲線

2.6 反應(yīng)條件優(yōu)化

試驗(yàn)對(duì)包被原和抗體濃度、pH、反應(yīng)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖6。包被原過(guò)高可能會(huì)形成空間位阻，阻礙抗原抗體的結(jié)合，過(guò)低則會(huì)降低電化學(xué)信號(hào)[26]。1 mg/mL的包被原從200倍開(kāi)始稀釋?zhuān)♂? 600倍時(shí)達(dá)到最大峰電流差[圖6(a)]?？贵w濃度直接影響檢測(cè)的靈敏度，所制備的金標(biāo)記抗體探針稀釋40倍時(shí)電流變化值最大[圖6(b)]。pH值一方面影響抗原—抗體反應(yīng)的親和性和抗原和抗體的活性，過(guò)高或過(guò)低的pH會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性；另一方面影響藥物的溶解度，從而影響其與抗原抗體的相互作用。當(dāng)反應(yīng)的緩沖溶液pH為7.5時(shí)，電化學(xué)信號(hào)變化值最大[圖6(c)]?？乖贵w反應(yīng)是可逆反應(yīng)過(guò)程，其反應(yīng)達(dá)到平衡需要一定的時(shí)間。反應(yīng)的孵育時(shí)間關(guān)系到抗原抗體的結(jié)合程度。當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到30 min后，電化學(xué)信號(hào)變化基本達(dá)到平衡[圖6(d)]，因此選取30 min作為反應(yīng)的孵育時(shí)間。

圖6 包被原和HRP-GNPs-Ab的稀釋倍數(shù)、pH、孵育時(shí)間對(duì)免疫傳感器性能的影響

2.7 傳感器的電流響應(yīng)

所制備的納米電化學(xué)傳感器基于直接競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)原理對(duì)AFB1進(jìn)行檢測(cè)。在最優(yōu)條件下，不同濃度AFB1引起的電化學(xué)響應(yīng)如圖7(a)所示。隨著AFB1濃度的降低，還原峰電流增加。以AFB1濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以體系加入過(guò)氧化氫前后電流變化值為縱坐標(biāo)作圖，采用Origin軟件進(jìn)行線性擬合得到校準(zhǔn)曲線[圖7(b)]：y=(22.36±0.13)-(4.78±0.07) lgx，R2=0.999 0，線性范圍為3.81 pg/mL～1.00 μg/mL，檢出限為1.13 pg/mL (S/N=3)。

圖7 免疫傳感器對(duì)AFB1檢測(cè)的CV響應(yīng)曲線和校準(zhǔn)曲線

所構(gòu)建的免疫傳感器與近兩年文獻(xiàn)報(bào)道的AFB1檢測(cè)方法相比，具有更寬的線性范圍及更低的檢測(cè)限，表明該傳感器具有一定的技術(shù)優(yōu)勢(shì)(見(jiàn)表1)。

表1 AFB1檢測(cè)方法比較

2.8 傳感器的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和特異性

穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和特異性是衡量傳感器能否在實(shí)際檢測(cè)中應(yīng)用的重要指標(biāo)。為評(píng)估免疫傳感器的重現(xiàn)性，制備的傳感器對(duì)5個(gè)不同濃度的AFB1進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)樣品均做3個(gè)重復(fù)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.47%～3.54%，表明傳感器具有良好的重現(xiàn)性。通過(guò)定期測(cè)量4 ℃保存的傳感器隨時(shí)間的變化，評(píng)估其穩(wěn)定性。結(jié)果表明，傳感器在14 d后的電流響應(yīng)為第1天的81.7%～85.5%，表明修飾的電極具有較高的穩(wěn)定性。對(duì)所構(gòu)建的AFB1傳感器的特異性進(jìn)行評(píng)估，在相同的條件下分別檢測(cè)AFB1及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物在1 μg/mL濃度所引起的電流變化值(圖8)。結(jié)構(gòu)類(lèi)似物引起的電流響應(yīng)變化值為AFB1的0.60%～6.21%，表明該傳感器具有良好的特異性。

圖8 免疫傳感器對(duì)AFB1及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的電流響應(yīng)變化值

2.9 實(shí)際樣品檢測(cè)

所構(gòu)建的傳感器用于實(shí)際樣品檢測(cè)，將其檢測(cè)結(jié)果與ELISA試劑盒進(jìn)行比對(duì)(表2)。結(jié)果表明，傳感器對(duì)樣品的檢測(cè)與ELISA法一致。檢測(cè)回收率在84.6%～107.6%，變異系數(shù)(CV)在5.42%～10.49%，說(shuō)明所構(gòu)建的傳感器可應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

表2 實(shí)際樣品添加回收率

3 結(jié)論

研究成功構(gòu)建基于納米材料的AFB1電化學(xué)傳感器。試驗(yàn)結(jié)果表明，該傳感器對(duì)黃曲霉毒素B1的檢測(cè)線性范圍在3.81 pg/mL～1.00 μg/mL，檢出限為1.13 pg/mL，對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)添加回收率在84.6%～107.6%，與ELISA檢測(cè)結(jié)果基本相符。所構(gòu)建的傳感器與文獻(xiàn)(表1)報(bào)道的AFB1檢測(cè)方法相比，具有較寬的線性范圍和較低的檢測(cè)限。該傳感器快速、靈敏，操作簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高，可應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。