郭 燕，賀 晨，段 勇，現(xiàn)紅斌，張 歡，李 錦

（陜西省血液中心，西安 710061）

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase,ALT）水平異常是肝臟損傷的敏感標(biāo)志，曾被當(dāng)作篩選肝炎病毒，尤其是丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）感染的替代指標(biāo)，一定程度上保障了輸血安全。隨著酶免篩查試劑靈敏度的不斷提高及核酸檢測技術(shù)（nucleic acid testing，NAT）的廣泛開展，美英等發(fā)達國家以及我國港澳臺地區(qū)，在常規(guī)開展血液NAT后即取消了ALT檢測[1]。ALT雖然目前仍是我國《無償獻血健康體檢要求》（GB18647-2011）規(guī)定的必檢項目，但大量學(xué)者研究結(jié)果顯示獻血人群中ALT水平異常與HBV，HCV感染并無相關(guān)性[2-4]，認為取消ALT檢測或提高ALT檢測域可以有效降低獻血者淘汰率和血液報廢率。

然而，也有研究提示ALT對HCV檢出有輔助作用，如CASTILLO等[5]在100例抗-HCV陰性，血清HCV RNA陰性，肝功能持續(xù)異常的患者中檢到HCV RNA，命名為“隱匿性丙型肝炎病毒感染（occult hepatitis C virus infection，OCI）”；LIN等[6]在113例ALT水平異常獻血者中檢出9例（7.96%）OCI，對照組并未檢出。ALT水平異常與獻血人群HBV，HCV感染是否相關(guān)？ALT對OCI獻血者是否有篩查作用？本文針對上述問題開展研究，現(xiàn)報告如下：

1 材料與方法

1.1 研究對象 98 697份血液標(biāo)本來自陜西省血液中心2019年1～6月初篩合格的無償獻血者，男性61 814人，女性36 883人，年齡18～60周歲。此外，隨機選擇2019年7～9月初篩合格的無償獻血者112例，ALT初篩＞50U/L的無償獻血者125例，男性176例，女性61例,年齡18～60周歲。每個獻血者同時留取3管標(biāo)本（EDTA-K2抗凝真空管），2管用于血型、酶聯(lián)免疫檢測和外周血淋巴細胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）提取，1管用于核酸檢測。本研究經(jīng)陜西省血液中心醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有參與研究的獻血者均自愿簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 HBsAg，抗-HIV-1和抗-HIV-2，抗-HCV，抗-TP檢測試劑盒分別購自北京萬泰，美國伯樂，珠海麗珠，上?？迫A和意大利索靈公司；PBMCs提取和HCV RNA檢測試劑包括天津灝洋人PBMCs分離液（LTS1077-1）；先鋒生物RNAfast1000總RNA提取試劑盒（RN03）；PromegaGoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（A5001）。實驗儀器包括olympus AU640全自動生化分析儀；Hamilton Fame全自動酶免分析儀；COBAS S 201核酸檢測系統(tǒng)；ABI 2720 PCR儀；BIO RAD GelDoc EZ凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 實驗方法

1.3.1 血液檢測：陜西省血液中心對無償獻血者血液樣本采用獻血前初篩和實驗室檢測兩個步驟。初篩項目包括Hb，HBV，HIV，ALT（≤50U/L為合格），合格者繼續(xù)完成獻血，不合格者延緩/停止獻血。實驗室則采用兩個不同廠家酶聯(lián)免疫檢測試劑對HBsAg，抗-HIV-1和抗-HIV-2，抗-HCV，抗-TP進行兩輪檢測，ALT采用速率法進行1次檢測（ALT復(fù)檢），任一項目陽性者視為不合格，無需進行NAT檢測。合格樣本采用COBAS S 201核酸檢測系統(tǒng)（6樣本混樣模式，6×167μl）繼續(xù)進行HCV，HIV，HBV核酸檢測，有反應(yīng)性的混樣池進行拆分試驗，鑒定出陽性標(biāo)本。

1.3.2 PBMCs分離提取：從3ml外周血中分離PBMCs，嚴格參照說明書操作，血液自采集至PBMCs收集不超過6h。分離的PBMCs經(jīng)500μl 1×PBS洗滌兩遍后加入500μl細胞凍存液，立即凍存于- 80℃冰箱，每管細胞數(shù)為1×106～1×107。

1.3.3 HCV RNA提取和檢測：PBMCs 37℃迅速融化，500μl 1×PBS洗 滌 兩次，細 胞總RNA提取及cDNA合成嚴格按照試劑盒說明書進行。Nested PCR檢測HCV RNA5’非編碼區(qū)[6]，兩輪PCR引物分別是F1：5’-CTGTGAGGAACTACTGTCT-3’(nt45～63),R1:5’-GTGCACGGTCTACGAGACCT-3’(nt321～302)；F2∶5’GAAAGCGTCTAGCCATGGCGT-3’(nt71～91),R2∶5’CCCTATCAGGCAGTACCACAA-3’(nt301～281)。4μl cDNA為模板，反應(yīng)條件為95℃ 3min；95℃ 30s,58℃ 30s,72℃30s；72℃ 8min，40個循環(huán)，第二輪PCR吸取4μl第一輪PCR產(chǎn)物為模板，擴增條件相同。

慢性丙型肝炎患者PBMCs HCV RNA陽性標(biāo)本；抗-HCV陰性且血漿及PBMCs HCV RNA陰性標(biāo)本；ddH2O分別作為陽性、陰性和空白對照以排除污染。目的產(chǎn)物230bp，切膠回收后送金唯智生物技術(shù)有限公司測序。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料運用χ2檢驗，均數(shù)組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 無償獻血者ALT，HBV，HCV檢測結(jié)果 98 697份血液標(biāo)本中ALT水平異常者654份（0.66%），其中ALT單項水平異常641份（98.01%）；ALT異常并發(fā)HBsAg陽性5份，占ALT不合格總數(shù)的0.76%（5/654）；ALT異常并發(fā)抗-HCV陽性3份，占ALT不合格總數(shù)的0.46%（3/654）；ALT并發(fā)肝炎病毒標(biāo)志物陽性者，僅占ALT不合格標(biāo)本的1.22%（8/654）。HBsAg單項陽性388份（0.39%），抗-HCV單項陽性448份（0.45%）。

2.2 肝炎病毒標(biāo)志物陽性組與陰性組ALT異常率比較 見表1。HBsAg陽性組和陰性組，抗-HCV陽性組和陰性組的ALT異常率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.23，0.00，均P＞0.05）。HBsAg陰性組、抗-HCV陰性組ALT均值高于對應(yīng)陽性組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.662，0.282，均P＞0.05）。

表1 肝炎病毒標(biāo)志物陽性組與陰性組 ALT均值及異常率比較

2.3 ALT初篩不合格獻血者HBV，HCV感染率及ALT水平比較 見表2。125例初篩ALT不合格的無償獻血者HBsAg陽性組ALT水平小于HBsAg陰性抗-HCV陰性組，抗-HCV陽性組ALT大于HBsAg陰性抗-HCV陰性組,組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.527，1.396，均P＞0.05）。ALT初篩不合格者HBV,HCV感染率(4.8%，6/125)大于ALT初篩合格者（0.86%，844/98 697）和復(fù)檢ALT不合格者（1.22%，8/654），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=22.78，7.61，均P＜0.05）。

表2 ALT初篩不合格獻血者HBV，HCV感染率[n（%）] 及ALT水平（±s，U/L）比較

表2 ALT初篩不合格獻血者HBV，HCV感染率[n（%）] 及ALT水平（±s，U/L）比較

組別 感染率 ALT HBsAg+3（2.46）64.73±13.96抗-HCV+3（2.46）149.47±94.71 HBsAg-抗-HCV- 119（95.20）73.05±27.13

2.4 NAT檢測結(jié)果 酶免及ALT檢測均合格樣品中，NAT檢出HBV DNA陽性46份(0.05%，46/96 585)；ALT單項異常的樣品NAT檢出HBV DNA陽性1份（0.16%，1/641），兩組HBV DNA檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.98，P＞0.05）。收集的125例ALT初篩單項不合格樣品，酶免檢測篩除HBV，HCV陽性后，剩余119例樣品和112份ALT初篩合格樣品NAT檢測結(jié)果均為陰性。

2.5 無償獻血者中OCI篩查結(jié)果 119例ALT單項異常者PBMCs中檢出1例HCV RNA陽性，112例合格獻血者PBMCs中未檢出HCV RNA。

3 討論

ALT是病毒性肝炎的一項非特異性檢測指標(biāo)，除病毒性肝炎、肝硬化、肝癌、藥物性肝炎等病理因素外，與年齡、體重、飲酒、劇烈運動、疲勞、藥物服用等非病理因素也有一定相關(guān)性[7]。我們的檢測結(jié)果顯示，ALT初篩合格的無償獻血人群中ALT水平異常與HBV，HCV感染并無關(guān)聯(lián)性。然而，由于初篩往往會排除ALT較高的獻血者，只利用ALT初篩合格樣品作為研究對象存在一定局限性。本研究中,初篩ALT不合格樣品的HBsAg/抗-HCV陽性率（4.8%）高于ALT初篩合格獻血者（0.86%）及ALT復(fù)檢不合格者（1.22%），一定程度上體現(xiàn)了ALT初篩對于防止血液資源浪費的必要性。此外，對不同組別ALT均值分析說明，HBV/HCV檢出與一定范圍內(nèi)的ALT水平并無嚴格的關(guān)聯(lián)性，如何設(shè)定更合理的獻血人群ALT檢測限來體現(xiàn)ALT與HBV/HCV相關(guān)性，需要多中心，大樣本檢測數(shù)據(jù)的不斷積累和探索。

NAT具有較高的敏感度和特異度，可縮短病毒檢測的“窗口期”，能有效檢出隱匿性乙肝病毒感染（occulthepatitis B virus infection，OBI）。OBI是一種特殊的HBV感染形式，基本特征為血清HBsAg陰性而肝細胞/血清HBV DNA 陽性，通常血清中HBV DNA 滴度≤200 IU/ml[8]。ALT單項異常標(biāo)本可檢出HBV DNA，說明HBV感染者ALT水平異常出現(xiàn)的時間可能早于HBsAg陽轉(zhuǎn)時間；而酶免和ALT檢測均合格的血液標(biāo)本可檢出HBV DNA，說明HBV DNA的出現(xiàn)早于ALT水平異常時間?？梢奛AT已能發(fā)現(xiàn)HBV前期感染或者OBI，絕大多數(shù)ALT水平異常者被誤排除。

OCI是一種特殊的HCV感染形式，僅能在患者肝組織和/或外周血淋巴細胞中檢測到HCV RNA，而血漿/血清中HCV RNA陰性[9]。OHCV具有HCV相似的傳染性[10]，可能與肝臟壞死性炎性活動及纖維化相關(guān)[5]。采供血機構(gòu)現(xiàn)行的ELISA和NAT技術(shù)并不能檢出OCI，是輸血安全面臨的潛在風(fēng)險。由于OCI可表現(xiàn)為抗-HCV陰性、血清 HCV RNA 陰性、僅肝功能異常的臨床狀態(tài)[11]，ALT水平異常對OCI檢出可能有一定的輔助作用。本研究在ALT單項不合格獻血者PBMCs中檢出OCI，合格獻血者未檢出OCI，一定程度上證明了ALT對OCI的篩查作用。

綜上所述，在酶免和NAT雙重檢測制度普及下，ALT篩查OBI，HBV，HCV及其窗口期的意義并不大。然而，由于ALT初篩不合格獻血者HBV/HCV感染率遠高于初篩合格者，ALT對OCI具有一定的篩查作用，對其他已知或未知肝炎病毒乃至肝臟疾病可能具有一定的輔助診斷作用，目前簡單取消獻血者ALT這一經(jīng)濟實惠的篩查方法并不合適。如何在減少血液浪費和保障血液安全之間取得理想平衡是值得每一個采供血機構(gòu)認真思考并不斷探討的命題。