童 偉，陳登奕，陳俊文，彭 瑩，李月紅

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院檢驗科，湖北襄陽 441000）

2019年12月以來，湖北省武漢市部分醫(yī)院陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多例有華南海鮮市場暴露史的不明原因肺炎病例[1]，并在隨后的1個多月內(nèi)迅速蔓延至全國。“早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早診斷、早治療”是目前應(yīng)對新型冠狀病毒的最有效手段，臨床對于新冠肺炎的診斷主要依據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)史、影像學(xué)檢查和實驗室檢查[2]。2020年3月3日國家衛(wèi)健委發(fā)布了《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》，第一次將2019-nCoV特異性抗體檢測納入臨床確診標(biāo)準(zhǔn)，同時國家藥監(jiān)局也應(yīng)急審批了廣州萬孚（膠體金試紙條）、英諾特（唐山）、博奧塞斯（重慶）和廈門萬泰（化學(xué)發(fā)光法）四家企業(yè)的注冊申請，本研究選取了廣州萬孚的膠體金法和廈門萬泰的化學(xué)發(fā)光法兩種不同的2019-nCoV總抗體檢測系統(tǒng)，從靈敏度、特異度等方面進(jìn)行評價，并比較各種系統(tǒng)的優(yōu)勢和缺點(diǎn)，為臨床選取合適的檢測策略提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》標(biāo)準(zhǔn)，選取2020年2月5日～25日我院收治的新型冠狀病毒肺炎確診病例和疑似病例（含臨床確診病例）81例，同時選取38例體檢人群作為健康對照組。根據(jù)兩次以上2019-nCoV核酸檢測結(jié)果，將病例分為確診病例組28例，女性11例，男性17例，年齡28～81歲，平均年齡（53.4±21.3）歲，兩次以上核酸結(jié)果陽性，均為發(fā)病7日以上；疑似病例組53例，女性25例，男性28例，年齡35～67歲，平均年齡（55.6±14.7）歲，有明確的流行病學(xué)接觸史及典型的臨床癥狀和肺部影像學(xué)特征，但兩次核酸結(jié)果陰性，均為發(fā)病7日以上；健康對照組38例，無明確的流行病學(xué)接觸史及典型的臨床癥狀和肺部影像學(xué)特征，且核酸結(jié)果陰性。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑：新型冠狀病毒（2019-nCoV）抗體（IgG+IgM）檢測試劑盒（廣州萬孚），樣本緩沖液（廣州萬孚），2019-nCoV總抗體（IgG+IgM）檢測試劑盒（廈門萬泰）。

1.2.2 儀器：低速離心機(jī)（安徽中佳），生物安全柜（山東新華），Caris200全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（北京萬泰）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣本收集與處理：采集所有研究對象靜脈血5ml，置于含分離膠的黃頭真空采血管內(nèi)，靜置20min,于生物安全柜內(nèi)2 500g離心10min,靜置30min，取血清備用。

1.3.2 膠體金法測定：采用新冠病毒抗體（IgG+IgM）檢測試劑盒按操作說明書進(jìn)行操作，該方法采用免疫層析技術(shù)原理，應(yīng)用捕獲法檢測人血清抗體。

1.3.3 化學(xué)發(fā)光法測定：使用Caris200全自動化學(xué)發(fā)光分析儀采用新冠病毒總抗體（IgG+IgM）檢測試劑盒進(jìn)行檢測，檢測前已做好校準(zhǔn)，該方法采用雙抗體夾心法，運(yùn)用吖啶酯化學(xué)發(fā)光原理檢測。測定儀根據(jù)RLU及內(nèi)置校準(zhǔn)曲線自動計算出S/CO值。樣本S/CO值＜1.0時為陰性，≥1.0時視為抗體有反應(yīng)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS15.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，疑似病例組數(shù)據(jù)使用配對資料χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 診斷特異度評價 分別用膠體金法和化學(xué)發(fā)光法檢測38例陰性對照組血清中2019-nCoV總抗體，膠體金法37例為陰性，1例弱陽性，診斷特異度為97.4%；化學(xué)發(fā)光法38例都為陰性，診斷特異度為100%。膠體金為弱陽性的一例患者無任何新冠病毒感染的臨床表現(xiàn)，進(jìn)而對該病例行影像學(xué)檢查，CT顯示兩肺清晰可見。詢問既往史得知其患有類風(fēng)濕，加查類風(fēng)濕因子為陽性，考慮可能由于類風(fēng)濕因子升高導(dǎo)致膠體金法檢測“假陽性”或“弱陽性”。

2.2 診斷敏感度評價 分別用膠體金法和化學(xué)發(fā)光法檢測28例確診病例組血清中2019-nCoV總抗體，兩種檢測方法全部陽性，即診斷敏感度為100%。

2.3 兩種方法在疑似病例診斷中的比較 分別用膠體金法和化學(xué)發(fā)光法檢測53例疑似病例組血清中2019-nCoV總抗體，結(jié)果詳見表1?；瘜W(xué)發(fā)光法和膠體金法在檢測疑似病例時兩種方法差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.78，P＞0.05）。疑似病例組有兩例患者血清中2019-nCoV總抗體用膠體金法檢測為弱陽性，而化學(xué)發(fā)光法均顯示陰性，經(jīng)醫(yī)院專家組會診討論，結(jié)合影像學(xué)和血細(xì)胞分析結(jié)果，不支持新型冠狀病毒肺炎，考慮兩例為“假陽性”。膠體金法作為經(jīng)典的免疫學(xué)定性檢測方法，通過肉眼觀察顏色來判斷陰陽性，為了保證較高的敏感度，彌補(bǔ)核酸檢測的假陰性率高的問題，有可能調(diào)低了檢測限的臨界值（cut-off值），或者因為某些原因檢測到其它無活性的病毒分子片段產(chǎn)生交叉反應(yīng)，從而造成“假陽性”或“弱陽性”的結(jié)果。

3 討論

2019-nCoV引發(fā)的肺炎疫情已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織定性為世界大流行。目前2019-nCoV病原學(xué)檢測方法主要包括病毒核酸檢測和血清抗體檢測，核酸檢測主要采用實時熒光RT-PCR方法[3]檢測鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等呼吸道中的病毒RNA。血清抗體檢測通常檢測患者血清或血漿樣本中的IgM，IgG抗體或特異性的總抗體[4]。一般情況下，IgM是初次免疫應(yīng)答最早出現(xiàn)的抗體，但持續(xù)時間不長，是近期感染的標(biāo)志物。IgG是再次免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要抗體，出現(xiàn)較晚，但持續(xù)時間長，且IgG滴度升高4倍以上可以作為再次感染的標(biāo)志。本研究采用的特異性總抗體包括了IgM和IgG在內(nèi)的全部新冠病毒特異性抗體，既具有IgM抗體檢測早期診斷新型冠狀病毒感染的優(yōu)勢，又具有檢測IgG抗體既往感染（包括處于恢復(fù)期IgM下降的患者）的特點(diǎn)。

本研究表明，膠體金法和化學(xué)發(fā)光法在檢測2019-nCoV總抗體時靈敏度和特異度都能夠達(dá)到臨床要求，對疑似病例的診斷無顯著差異，在應(yīng)用價值上各有優(yōu)缺點(diǎn)。膠體金法檢測不需要設(shè)備，方便快捷，適合于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)和社區(qū)進(jìn)行篩查試驗，但是結(jié)果無法定量，對于弱陽性的結(jié)果靠肉眼判斷比較困難，易受類風(fēng)濕因子、異嗜性抗體、補(bǔ)體等干擾物質(zhì)干擾，容易產(chǎn)生“假陽性”結(jié)果。因此遇到“弱陽性”結(jié)果需要更換檢測方法復(fù)查?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測2019-nCoV抗體可以采用接收機(jī)工作特征（Receiver Operating characteristic,ROC）曲線確定陽性判斷值[5]，做到相對定量，而且使用大型自動化儀器進(jìn)行檢測，操作安全，高通量，結(jié)果可靠性強(qiáng)，因此更適合綜合性醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行大批量檢測或體檢機(jī)構(gòu)進(jìn)行大規(guī)模篩查。但對單個樣本檢測時間一般大于30min，不適合特殊場合的快檢需求。

由于本研究病例數(shù)量有限，可能對兩種方法的應(yīng)用評價還不全面，需要進(jìn)一步收集更多相關(guān)病例資料。同時對比的兩種方法均為免疫學(xué)檢測方法檢測患者血清中抗體的水平，而抗體的產(chǎn)生都有窗口期，此時免疫學(xué)方法就無法對其進(jìn)行有效檢測。因此抗體檢測對核酸檢測容易漏檢的問題是很好的補(bǔ)充，將在新型冠狀病毒肺炎的診斷、治療監(jiān)測和病程轉(zhuǎn)歸等方面提供更多的臨床數(shù)據(jù)[6]。