李純，孫麗霞，孫建華，周利琴，徐大鵬，張友全，廖丹葵

（廣西大學化學化工學院，廣西石化資源加工及過程強化技術重點實驗室，廣西南寧530004）

近年來，中國化工行業(yè)的迅速崛起提升了人們的生活水平，但與此同時也使得中國水資源污染問題越來越嚴重。以酚類物質(zhì)為例，它對人體、動植物具有較大毒性，如鄰苯二酚會抑制中樞系統(tǒng)，干擾白細胞DNA的合成，當其處于0.1～0.2mg/L范圍時，魚肉會存在異味，高濃度含酚廢水會使農(nóng)作物枯死、減產(chǎn)[1]；而煉油、煉焦等工業(yè)生產(chǎn)過程所產(chǎn)生的廢水中均含有酚類物質(zhì)，如何快速準確檢測工業(yè)廢水是否達到國家排放要求也成為了研究的熱門領域。

電化學生物傳感器在生物分析、環(huán)境監(jiān)測和工業(yè)領域變得越來越重要。酪氨酸酶生物傳感器中的酪氨酸酶被稱作酚類氧化酶，由于其具有簡單、高選擇性和成本相對較低的優(yōu)點而受到廣泛研究，且已被廣泛用于酚類化合物的檢測[2-3]。針對生物傳感器，酶在合適基質(zhì)上負載及其穩(wěn)定性是保證生物傳感器具有優(yōu)異性能的重要因素。酶可通過物理吸附、交聯(lián)、自組裝、加入碳糊、聚合物和溶膠凝膠等多種方法實現(xiàn)酶的固定化；另一方面，納米結構載體由于具有較高的比表面積、較高的酶載量、理想的微環(huán)境以及酶活性位點與電極之間可直接電子轉移的優(yōu)點，能很好地保持其生物活性[4]，利用二氧化鈦（TiO2）、碳納米管和ZrO2/殼聚糖等載體制備酪氨酸酶生物傳感器均有報道[5-7]。氧化鋅（ZnO）由于具有較高的等電位點（IEP，約為9.5）而適宜于吸附等電位點低的蛋白質(zhì)，同時ZnO的生物相容性較好，因此以此為載體負載酶對保持酶活性具有積極作用。由于微納米纖維材料的大比表面積可有效地提高生物傳感器的性能，而大規(guī)模制備ZnO 微納米纖維，靜電紡絲是最有效的技術[8]。因此，本文采用靜電紡絲技術合成了ZnO 微納米纖維，并研究了該材料制備酪氨酸酶生物傳感器檢測鄰苯二酚，期待制備一種方便高效的生物傳感元件。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

玻碳電極、Ag/AgCl 電極、鉑片電極，中國武漢高仕睿聯(lián)科技有限公司；酪氨酸酶（酶活力7164U/mg），德國Sigma Aldrich 公司；聚乙烯吡咯烷酮（PVP，K88-96），上海阿拉丁試劑有限公司；乙酸鋅，國藥集團化學試劑有限公司；N,N-二甲基甲酰胺（DMF），天津富宇精細化工有限公司；殼聚糖（CS），浙江金殼生物化學有限公司；多巴胺、鄰苯二酚、葡萄糖、尿素，上海麥克林生化科技有限公司。

靜電紡絲機，E02型，廣東佛山輕子精密測控技術有限公司；電化學工作站，IviumStat型，荷蘭Ivium Technology 公司；馬弗爐，L40/12 型，德國Nabertherm 公司；X 射線雙晶粉末衍射儀（XRD），RIGAKU型，日本株式會社理學公司；掃描電子顯微鏡（SEM），S-3400N型，日本日立公司。

1.2 ZnO微納米纖維的制備

稱取1.1478g PVP 溶于5mL DMF 溶劑，稱取1.5000g 乙酸鋅溶于5mL 純水，待兩溶液充分混合并在密封條件下攪拌12h即得所需紡絲液。將紡絲液注入針管中，針頭與接收鼓前端的距離為17cm，設置正負電壓差約為16kV，紡絲速率為0.6mL/h，設置完成后進行紡絲操作得ZnO前體。

將ZnO前體置于馬弗爐中進行煅燒，煅燒時升溫速率設置為1℃/min，升溫至650℃后保溫2h 得到ZnO微納米纖維。

1.3 Tyr/ZnO/CS/GCE工作電極的制備

將玻碳電極用Al2O3拋光粉反復打磨并用水沖洗干凈，按照水、乙醇∶水=1∶1、水、硝酸∶水=1∶1、水的順序?qū)﹄姌O進行超聲處理直至電極表面呈鏡面狀。再用1mol/L H2SO4溶液對玻碳電極進行電化學清洗，當電極在5.0mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6（1∶1）溶液中（含0.1mol/L KCl）的CV 曲線氧化峰與還原峰差值在100mV 以內(nèi)后即可清洗保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取一定質(zhì)量ZnO加入超純水中得到樣液，分別量取樣液和0.3mg/mL的酪氨酸酶溶液各10μL充分混合后滴加在處理過的玻碳電極上，再滴加7μL濃度為2mg/mL 的CS 溶液，置于4℃條件下干燥一夜即得Tyr/ZnO/CS/GCE工作電極。

1.4 結構與形貌表征

采用SEM 觀察所制材料的微觀形貌，采用XRD表征材料的晶型結構。

1.5 電化學測試

實驗采用三電極體系，對電極采用鉑片電極，參比電極采用Ag/AgCl 電極，工作電極為自制Tyr/ZnO/CS/GCE 電極，采用IviumStat 型電化學工作站進行性能測試。采用CV 在氧化還原探針為5.0 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6（1∶1） 溶 液（含0.1mol/L KCl），掃描范圍為-0.4～0.8V 條件下進行不同掃描速率下CV測試，采用交流阻抗法（EIS）對不同工作電極進行EIS測試；工作電勢設為-0.2V，采用計時電流法在不同濃度鄰苯二酚溶液中進行IT 測試，利用公式LOD=3σ/S 計算最低檢測限（LOD），其中σ為未加鄰苯二酚時電流值的標準偏差（10 次重復），S 為校準曲線的斜率（實驗過程見圖1）。

圖1 實驗過程示意圖

2 結果與討論

2.1 ZnO形貌及結構表征

圖2(a)為煅燒后ZnO的SEM圖，可知煅燒后材料整體仍保持粗細均勻的纖維狀，纖維直徑約為400nm，且該纖維表面不光滑，由近似球狀的顆粒連接而成，原因是在制備時未加入表面活化劑，導致表面張力過大使納米纖維轉化為珠狀顆粒[9]，這為酶的附著提供了更多的附著位點[10-11]。圖2(b)為Tyr/ZnO/CS電極材料的SEM圖，可知酪氨酸酶可附著在納米纖維之間空隙中，且仍可基本保持ZnO的纖維形貌。

從圖2(c)煅燒后ZnO材料的XRD圖及其對應的標準卡片比較可知，ZnO為六方晶系，其主衍射峰可完全與ZnO標準卡片對應，說明靜電紡絲法所制前體經(jīng)過煅燒后可合成高純度的ZnO微納米纖維。

2.2 Tyr/ZnO/CS/GCE工作電極電化學性能檢測

圖3為Tyr/ZnO/CS/GCE工作電極在不同掃描速率下測得的CV 曲線及峰電流與掃描速率平方根的關系曲線。該電極有明顯的氧化還原峰，對比發(fā)現(xiàn)基于電化學沉積法制備的ZnO生物傳感電極在相同測試條件下氧化還原峰峰電流值與本試驗結果基本接近，說明Tyr/ZnO/CS/GCE 工作電極具有較好的直接電子傳輸能力[12]。而圖3(b)工作電極氧化和還原峰峰電流值與掃描速率平方根的線性關系表明該工作電極在反應時控制步驟為擴散控制[13-14]。

2.3 工作電極性能測試條件優(yōu)化

2.3.1 pH對工作電極性能的影響

圖2 ZnO形貌及結構圖

電解液pH 會影響電極性能，當酶活性大時，底物鄰苯二酚單位時間被氧化還原的量增大，表現(xiàn)為工作電極的電信號增強。將工作電極置于不同pH的1mmol/L 鄰苯二酚溶液中進行CV測試，結果見圖4。由圖可知，還原峰峰電流響應值在pH=5～7.5 范圍先增大后減小，在pH=5.5 時電流響應值最大為-19.97μA，這是因為酪氨酸酶在酸性條件下活性更好[15]，因此使得還原峰峰電流響應值在酸性條件下更大。

圖3 Tyr/ZnO/CS/GCE工作電極的電化學性能圖

2.3.2 ZnO添加量對工作電極性能的影響

固定化酶載體量會對電流響應產(chǎn)生影響，考察了ZnO 負載酪氨酸酶的工作電極對應CV 曲線中還原峰峰電流響應值的變化情況，如圖5 所示。在-0.4～0.8V 的掃描范圍內(nèi)，ZnO 濃度為3mg/mL 時還原峰峰電流響應值最大為-22.20μA，當ZnO 濃度過大時峰電流值反而減小，這是由于ZnO添加量過多會增加電流阻力，從而導致電子轉移能力下降[16]；而當ZnO濃度過小時酪氨酸酶分子在載體表面可能形成擁擠并增大對擴散過程的限制程度，這會使還原峰峰電流值減小[17]。

2.3.3 溫度對工作電極性能的影響

溫度是影響電極性能的重要因素，底物鄰苯二酚單位時間被氧化還原的量增大，表現(xiàn)為工作電極的傳感信號增強，圖6為不同溫度對工作電極傳感性能的影響曲線，由圖可知，工作電極在20～35℃溫度范圍內(nèi)可保持較大的穩(wěn)態(tài)電流差值，當溫度高于35℃時穩(wěn)態(tài)電流差值降低較快，這可能是由于溫度升高會改變酪氨酸酶構象，影響酪氨酸酶活性，進而使穩(wěn)態(tài)電流差值降低[18]。

圖4 工作電極在不同pH下還原峰電流測試結果

圖5 工作電極在不同ZnO添加量下還原峰電流測試結果

圖6 工作電極在不同溫度下穩(wěn)態(tài)電流差值測試結果

2.4 工作電極傳感性能檢測

在上述優(yōu)化條件下采用計時電流法以Tyr/ZnO/CS/GCE 為工作電極檢測鄰苯二酚。在電解液中先滴加2.5μmol/L鄰苯二酚溶液，再連續(xù)滴加5μmol/L鄰苯二酚溶液得到計時電流曲線見圖7(a)。由圖7(a)可知，即使加入微量的鄰苯二酚也能引起響應電流的快速增大，且達到穩(wěn)定電流所需時間小于5s，表明該修飾電極對鄰苯二酚有良好的催化能力，但超過該電極的檢測范圍后電流值將不再繼續(xù)變化。不同鄰苯二酚濃度與對應電流值的擬合結果見圖7(b)，該方法檢測鄰苯二酚的線性檢測范圍為5～50 μmol/L，傳感元件靈敏度為376.31μA/(mmol·L·cm2)，最低檢測限為1.9041μmol/L。

表1為部分電化學生物傳感器檢測酚類物質(zhì)時的效果，純ZnO無酶傳感器檢測范圍較窄且靈敏度不大，而還原氧化石墨烯（rGO）的加入會極大地提高傳感元件的靈敏度[19-20]。對于酪氨酸酶生物傳感器，以1-乙烯基-3-乙基咪唑溴化銨（ViEtIm+Br-）聚合物微粒為載體的傳感元件適用于檢測高濃度酚類物質(zhì)[21]，而以2-羥基苯甲酰胺（2-HBZ）為載體的傳感元件適用于檢測極低濃度酚類物質(zhì)[22]。相比于氣相傳輸法制備的Tyr/ZnO-NR/GCE 電極，利用靜電紡絲法制備的Tyr/ZnO/CS/GCE 電極檢測限和靈敏度均有一定改善[23]，且靜電紡絲法適用于大規(guī)模制備，因此該電極在檢測酚類物質(zhì)時有一定優(yōu)勢。

圖7 傳感性能分析圖

2.5 ZnO對工作電極傳感性能的影響

為研究ZnO對工作電極傳感性能的影響，比較了Tyr/ZnO/CS/GCE 電極和Tyr/CS/GCE 電極在相同體系中的傳感性能。Tyr/CS/GCE 電極IT 測試結果見圖8，該電極在檢測鄰苯二酚時檢測范圍為5～40μmol/L，靈敏度為856.80μA/(mmol·L·cm2)。與Tyr/ZnO/CS/GCE 電極IT 測試結果對比，Tyr/ZnO/CS/GCE 電極的檢測范圍比Tyr/CS/GCE 電極更寬，但靈敏度稍低于Tyr/CS/GCE 電極，這可能是由于ZnO 導電性較差的原因[圖8(c)][4]。同時，Tyr/ZnO/CS/GCE 電極穩(wěn)態(tài)電流值在鄰苯二酚濃度超過65μmol/L 后趨于平穩(wěn)，且不會衰減，而Tyr/CS/GCE電極穩(wěn)態(tài)電流值在鄰苯二酚濃度超過50μmol/L后逐漸下降，本文作者認為是由于酪氨酸酶活性降低導致穩(wěn)態(tài)電流值減弱，由此認為ZnO 微納米纖維材料可使酪氨酸酶更穩(wěn)定[24]。

圖8 ZnO對工作電極傳感性能的影響及導電性對比分析圖

2.6 Tyr/ZnO/CS/GCE 電極抗干擾性和循環(huán)穩(wěn)定性測試

選取尿素、多巴胺和葡萄糖這3種電化學活性相近的物質(zhì)進行Tyr/ZnO/CS/GCE 電極抗干擾性測試，結果見圖9(a)。每次加入5μmol/L鄰苯二酚后，電流值均會發(fā)生明顯變化，可斷定該電極會對鄰苯二酚產(chǎn)生響應。當分別加入5μmol/L葡萄糖、尿素和多巴胺時，電流值只產(chǎn)生了微小波動[圖9(b)]，其中，加入葡萄糖對檢測鄰苯二酚過程的干擾影響最大，但其電流變化量也僅為加入鄰苯二酚時的4.9%，由此可認為該工作電極使這3種物質(zhì)對檢測鄰苯二酚的傳感過程干擾很小，表明該電極具有良好的抗干擾性。通過對Tyr/ZnO/CS/GCE 電極進行循環(huán)穩(wěn)定性測試發(fā)現(xiàn)，該電極在15 天后可保持初次測試性能的91%，30 天后仍可保持原性能的82%，表明該電極循環(huán)穩(wěn)定性良好[25]。

圖9 Tyr/ZnO/CS/GCE電極抗干擾性結果

3 結論

利用靜電紡絲法制備了由近似球狀的顆粒連接而成的ZnO微納米纖維材料。利用該ZnO微納米纖維材料構建了Tyr 生物傳感器用于檢測鄰苯二酚，在優(yōu)化檢測條件下，Tyr/ZnO/CS/GCE 電極對鄰苯二酚的檢測范圍為5～50μmol/L，檢測限為1.9041 μmol/L，靈敏度為376.31μA/(mmol·L·cm2)，在加入尿素、多巴胺和葡萄糖這3種電化學活性相近物質(zhì)的情況下仍能表現(xiàn)出很好的抗干擾性，且循環(huán)穩(wěn)定性良好。因此，該生物傳感器經(jīng)過進一步改性后有望被視為潛在的工業(yè)廢水中酚類物質(zhì)含量檢測方法。