焦?fàn)I營，曾曉媛，李宗鵬，張玉嬌，劉啟發(fā)，葉潔瑜

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510515

原發(fā)性免疫性血小板減少癥（ITP）雖然是非惡性疾病，但因高出血風(fēng)險(xiǎn)及明顯乏力癥狀，患者生活質(zhì)量非常差，甚至低于大部分癌癥患者［1-2］。ITP一線治療藥物是糖皮質(zhì)激素，有效率達(dá)70%～80%，但在藥物減量或停藥過程中有相當(dāng)大部分患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，而對(duì)于這種激素耐藥/依賴患者目前仍缺乏有效治療方案。既往考慮血小板破環(huán)過多是ITP發(fā)病主要原因，近年來學(xué)者們強(qiáng)調(diào)血小板生成減少也是重要因素。然而，針對(duì)ITP患者血小板生成減少的研究仍十分局限，目前比較明確的發(fā)現(xiàn)僅僅是巨核細(xì)胞（MK）生成受抑制［3-4］，但其中具體機(jī)制尚不明確。血小板造血是極其復(fù)雜的生理過程，受到多種因素調(diào)控。即使血小板水平相同的ITP患者其出血癥狀卻差異很大，這種強(qiáng)異質(zhì)性現(xiàn)象提示還有一些未知因素參與ITP的發(fā)病。

機(jī)體的正常造血除了依靠造血細(xì)胞，還依賴于支持造血細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的“造血微環(huán)境”，主要由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨髓內(nèi)皮細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組成［5］。巨核細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育受到造血微環(huán)境中多種因素的精細(xì)調(diào)節(jié)［6］，微環(huán)境中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及骨髓內(nèi)皮細(xì)胞主要通過分泌細(xì)胞因子；以及通過細(xì)胞表面的粘附分子與巨核細(xì)胞相互接觸，促進(jìn)巨核細(xì)胞的成熟及遷移［7］。在病理狀態(tài)下，體內(nèi)的造血微環(huán)境也會(huì)發(fā)生改變［8］，進(jìn)而影響巨核細(xì)胞造血。近期研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者的內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）功能明顯受損［9］；動(dòng)物模型的電鏡檢查果提示，ITP組的動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與對(duì)照組明顯不同，實(shí)驗(yàn)組的吞飲小泡減少，細(xì)胞間隙明顯增大［10］；另外，ITP組動(dòng)物的血漿vWF水平明顯增高，這些都是ITP內(nèi)皮細(xì)胞受損的表現(xiàn)。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：TPO可減少缺氧誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用［11］。因此我們推測(cè)，TPO可能通過修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞功能，恢復(fù)其對(duì)MK細(xì)胞的造血支持作用，從而促進(jìn)血小板生成。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年3月1日～11月31日在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血液科22例確診ITP患者的骨髓作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，并且獲得健康供者捐贈(zèng)的骨髓（n=10）作為健康對(duì)照組，患者和健康供者骨髓標(biāo)本的獲取均通過南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得患者及健康供者知情同意。

1.2 試劑與儀器

BM-EC細(xì)胞來自ITP患者及供者,AnnexinV/PI凋亡試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），EBM-2培養(yǎng)基（廣州優(yōu)寧維生物科技有限公司），胎牛血清（廣州優(yōu)邦生物科技有限公司），24孔板及6孔板（廣州杰特偉生物科技有限公司），TPO為臨床剩余廢棄，胰蛋白酶（英濰捷基貿(mào)易有限公司），CCK-8試劑盒（東仁化學(xué)科技有限公司），倒置顯微鏡（德國萊卡儀器股份有限公司）；AIRTECHVS-1300L-U超凈工作臺(tái)（上海整新電子設(shè)備廠）；自動(dòng)定量酶標(biāo)儀（Bio-Rad）；5%CO2恒溫培養(yǎng)箱（香港Heal Force HF100型）；離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；FACSCaliburTM（BD Biosciences）流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson）。鼠抗CD34/CD133/CD309（廣州賽哲生物科技有限公司），Lonza-EGM-2培養(yǎng)基（上海優(yōu)寧維生物科技有限公司）。DIL-AC-LDL（廣州新進(jìn)度生物科技有限公司），F(xiàn)ITC-UEA(sigma)、青鏈霉素混合液（廣州科進(jìn)生物有限公司），基質(zhì)膠（coring）（廣州賽哲生物科技有限公司），明膠（上海翊圣生物科技有限公司）。

1.3 內(nèi)皮祖細(xì)胞分離、培養(yǎng)

采用淋巴細(xì)胞分離液分離法分離ITP患者及供者骨髓標(biāo)本，獲得單個(gè)核細(xì)胞，置于10%血清，1%雙抗的EGM-2培養(yǎng)基（含內(nèi)皮祖細(xì)胞生長(zhǎng)因子）中重懸。以1×106/mL接種于預(yù)涂1%明膠的24孔板內(nèi)。將所提取ITP患者的單個(gè)核細(xì)胞分兩組：實(shí)驗(yàn)組加入濃度為100 ng/mL的TPO，對(duì)照組不添加TPO，同時(shí)按照上述提取BM-EPC方法提取健康人骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行BM-EPC培養(yǎng)，作為健康對(duì)照組。將其放入37℃、5%CO2敷箱培養(yǎng)，每隔3 d換液，并觀察細(xì)胞形態(tài)，長(zhǎng)至80%～90%融合狀態(tài)時(shí)棄去舊培養(yǎng)基，PBS清洗1～2次，加入0.25%EDTA胰酶放入37℃、5%CO2敷箱1 min左右，鏡下觀察當(dāng)細(xì)胞皺縮、變圓、細(xì)胞間間隙變大時(shí)用含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打至細(xì)胞完全脫落，離心收集細(xì)胞傳代。

1.4 細(xì)胞表面標(biāo)志及鑒定方法

1.4.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面CD34/CD133/CD309表達(dá) 收集不同處理組培養(yǎng)7 d的細(xì)胞，離心收集至流式管，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL，分別加入5 μL的鼠抗CD34/CD133/CD309混勻置于4℃冰箱避光孵育20～30 min，PBS洗2次上機(jī)檢測(cè)。

1.4.2 DIL-AC-LDL及FITC-UEA-1實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)吞功能 首先將DIL-AC-LDL用EGM-2培養(yǎng)基稀釋成2.5 μg/mL FITC-UEA-1生理鹽水稀釋至10 μg/mL。收集不同處理組培養(yǎng)7 d的細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)基，PBS輕輕清洗1～2次，加入DIL-AC-LDL（2.5 μg/mL）放置37 ℃、5%CO2敷箱3～4 h，取出后倒掉其液體PBS洗3次，加入4%多聚甲醛固定20 min，其后棄去液體，PBS洗3次，每次5 min，加入 FITC-UEA-1（10 μg/mL）放置敷箱2 h，取出后PBS洗3次，每次5 min，置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ITP患者BM-EC，接種于96孔板中，96孔板周圍邊緣孔用無菌PBS填充，TPO以0、50、100、200 ng/mL不同劑量組加入96孔板中，使得總體積為100 μL。作用24 h后，將液體棄去，全部換為無血清EGM-2培養(yǎng)基，并加入10 μL CCK8試劑，反應(yīng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞吸光度A450nm。細(xì)胞增殖率（%）=［（實(shí)驗(yàn)組吸光度-空白組吸光度）（A450nm）（/對(duì)照組吸光度-空白組吸光度）（A450nm）］×100%。

1.6 細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)

預(yù)先將96孔板及槍頭預(yù)冷，將50 μL Matrigel加入96孔板中，放入37℃孵箱中30 min。用胰酶消化各組BM-EC并用ECM培養(yǎng)基重懸，以2×104細(xì)胞（總體積50 μL）種入預(yù)先放有Matrigel的96孔板中，12 h后顯微鏡下觀察，使用Image J.測(cè)量其管長(zhǎng)度。

1.7 EPC與MK共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

取不同處理組對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞，用胰酶消化BM-EC并用完全培養(yǎng)基重懸，以3×105細(xì)胞種于6孔板內(nèi)，待其完全貼壁后加入1×105巨核細(xì)胞，37℃、5%CO2敷箱培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL，分別加入5 μL的鼠抗CD41a混勻置于4℃冰箱避光孵育20～30 min，PBS洗2次上機(jī)檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS22.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；兩樣本比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞形態(tài)觀察

鏡下細(xì)胞分離接種初期為單個(gè)核細(xì)胞形態(tài)，第3天細(xì)胞開始變大，有聚集成團(tuán)的現(xiàn)象。5～7 d細(xì)胞開始出現(xiàn)不規(guī)則形、梭形；9～10 d為典型的EPC細(xì)胞形態(tài)（圖1）。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面CD34/CD133/CD309表達(dá)

用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理組BM-EPC表面相關(guān)CD分子表達(dá)水平,結(jié)果顯示，所培養(yǎng)的細(xì)胞表面表達(dá)CD34、CD309及CD133的細(xì)胞率占80%以上（圖2）。

2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

TPO 0、50、100、200 ng/mL作用于BM-EPC 24 h，在100 ng/mLTPO作用下增殖率達(dá)到最大，這為理想的藥物濃度，綜合考慮選用100 ng/mL的TPO處理細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)（圖3）。

2.4 細(xì)胞DIL-AC-LDL及FITC-UEA-1實(shí)驗(yàn)

采用免疫熒光方法檢測(cè)不同處理組BM-EC DILAC-LDL及FITC-UEA-1雙染陽性細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示，不同處理組培養(yǎng)的BM-EPC均為陽性，并且TPO處理組明顯高于未處理組（圖4）。

2.5 細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)

不同處理組細(xì)胞接種在鋪有Matrigel的96孔板中，12 h后的顯微鏡下結(jié)果（圖5）。TPO處理組成管能力高于未處理組其結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=8，P＜0.05）。

2.6 EPC與MK共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

使用6孔板直接共培養(yǎng)BM-EPC與MK，48 h后，流式上機(jī)檢測(cè)不同處理組CD41a的表達(dá)，使用TPO處理組CD41表達(dá)明顯高于未處理（圖6）。

3 討論

當(dāng)前研究表明，ITP患者BM-EPCs功能受損，主要表現(xiàn)為增殖能力、成管功能及支持巨核細(xì)胞造血功能下降，在體外TPO處理后，EPCs數(shù)量明顯增加，成管功能明顯增強(qiáng)，共培養(yǎng)MK數(shù)量明顯增多。TPO及c-mpl已被證實(shí)在除了造血干/祖細(xì)胞及巨核系統(tǒng)以外的多種細(xì)胞中表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)皮細(xì)胞及EPC均表達(dá)c-mpl，TPO通過c-mpl受體發(fā)揮生物學(xué)作用［12-13］；另有研究表明通過對(duì)骨髓移植后的小鼠輸注BM-EPC可以加速移植后各系功能重建，促進(jìn)HSC增殖［14］。此外，TPO刺激造血干細(xì)胞中的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）的產(chǎn)生，VEGF是對(duì)HSC生理至關(guān)重要的一種細(xì)胞因子［15］。本研究提示TPO對(duì)ITP患者BM-EPCs有促增殖及恢復(fù)其支持巨核細(xì)胞造血的作用。其機(jī)制可能是TPO通過增加EPCs數(shù)量，加大與巨核細(xì)胞間的直接接觸，另一方面可能是通過促進(jìn)分泌VEGF、SDF-1等細(xì)胞因子促進(jìn)HSC向MK分化從而增強(qiáng)其支持巨核細(xì)胞造血功能［16］。但TPO處理后的BM-EPC是否可以通過增加造血因子的分泌影響巨核細(xì)胞造血，還需進(jìn)一步研究。

BM-EPC在刺激因子作用下可分化成成熟內(nèi)皮細(xì)胞，具有成管和遷移特性，對(duì)于新生血管的形成和血管的修復(fù)具有重要意義［17］。內(nèi)皮細(xì)胞的成管功能是參與機(jī)體止血的重要環(huán)節(jié)［18］，ITP患者的出血癥狀不僅僅與血小板減少相關(guān)，可能與內(nèi)皮的成管功能受損也有很大的關(guān)系。本研究結(jié)果表明，TPO可修復(fù)ITP患者EPC的成管功能；這可能是臨床使用TPO類制劑，例如重組人血小板生成素以及TPO受體激動(dòng)劑減少出血癥狀的機(jī)制之一［19-20］；同時(shí)也解釋了一部分ITP患者即使血小板數(shù)量增高不明顯，出血癥狀也可明顯改善，可能與這部分患者EPC成管功能得以恢復(fù)有關(guān)。另外，文獻(xiàn)報(bào)道TPO/c-mpl可激活Src激酶通路［21］，而Src-ERK通路在內(nèi)皮細(xì)胞的成管功能中發(fā)揮重要作用［22］，故TPO是否也通過此通路修復(fù)EPC的成管功能仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，TPO對(duì)ITP患者受損的內(nèi)皮細(xì)胞具有修復(fù)作用，主要表現(xiàn)為成管功能及巨核細(xì)胞支持功能明顯增強(qiáng)。本研究進(jìn)一步完善了TPO的生理學(xué)作用及促巨核細(xì)胞造血的作用機(jī)制，為臨床ITP患者合理使用TPO類試劑提供了理論依據(jù)。