劉 晶， 馬建增， 劉淑榮， 鄭海亮

（山東省陽光融和醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，濰坊 261000）

子宮內(nèi)膜癌是一種常見的上皮性惡性腫瘤性疾病，是目前女性生殖道三大惡性腫瘤之一，且發(fā)病率逐年升高，嚴重危害女性生命健康[1]。姜黃素是一種傳統(tǒng)中藥，其藥理學作用廣泛，具有抗炎、抗氧化、調(diào)血脂、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等作用[2]，近年來其抗腫瘤作用日漸受到諸多醫(yī)學工作者的關(guān)注，成為研究的熱點。研究[3-4]報道，姜黃素可有效抑制肝癌Huh7 細胞、子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細胞增殖，抗腫瘤作用顯著，但目前關(guān)于其抗腫瘤作用機制尚不明確，因此，本研究通過探究姜黃素對子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細胞增殖、侵襲能力的抑制作用，并分析其對HEC-1-B 細胞蛋白表達的影響，為其臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株

子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細胞，購于中國醫(yī)學科學院細胞中心。

1.2 主要試劑

姜黃素（廣州龍德生物科技有限公司，純度99%，生產(chǎn)批號：SC20141011000026）、胎牛血清、RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國 Gibco 公司）、噻唑藍（MTT）試劑盒（天津科瑞杰生物技術(shù)開發(fā)有限公司）、Matrigel 膠（美國 BD 公司）、鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9（MMP-2、MMP-9）多克隆抗體（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）、鼠抗人細胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）（美國 Santa Cruz 公司）等。

1.3 主要儀器

HERACELL150i 型細胞培養(yǎng)箱（德國Thermo scientific公司）、Transwell 小室（美國Millipore公司）、CKX41 型光學倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）、SW-CJ-IFD 型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、Elx800 酶標儀（美國Bio-Tek 公司）、Quantity One 1-D 分析軟件（美國Bio-Rad 公司）等。

1.4 方法

1.4.1 子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細胞培養(yǎng)、分組及處理 用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的 RPMI-1640 培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細胞，并進行常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)期HEC-1-B 細胞進行實驗研究，以胰蛋白酶調(diào)整細胞密度為5×106個/mL 的細胞懸液，接種于96孔板中，200 μL/孔，設(shè) 8 復孔對照，低、中、高劑量實驗組與對照組HEC-1-B 細胞分別以30、60、120 μmol·L-1姜黃素及等量生理鹽水處理，各組分別處理24、36 和48 h。

1.4.2 MTT 法檢測HEC-1-B 細胞增殖情況 細胞分組與處理同1.4.1，各組設(shè)8 個復孔對照，且實驗重復3 次，具體如下：分別于干預(yù)24、36 和48 h時，加入 MTT 溶液，每孔 10 mg·mL-1，培養(yǎng) 4 h，棄上清，避光加150 μL/孔二甲基亞砜溶液，輕微震蕩，以全自動酶標儀檢測各孔490 nm 處的光密度（OD）值，計算細胞增殖抑制率。HEC-1-B 細胞增殖抑制率（%）＝（對照組OD490nm-低、中、高劑量實驗組 OD490nm）/對照組 OD490nm×100%[5]。

1.4.3 Transwell 小室實驗檢測HEC-1-B 細胞侵襲能力 以預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基適當稀釋Matrigel（體積比 1 ∶5），將 Matrigel（100 μL）覆 蓋Transwell 小室上室，放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育3 h。細胞分組及處理同1.4.1，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL 的細胞懸液，上室加入100 μL 細胞懸液，下室加入600 μL 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育 48 h 后取出小室，小心擦拭上室內(nèi)側(cè)面未遷移出的細胞，以甲醛固定30 min，室溫下加0.1%結(jié)晶紫染色25 min。光學顯微鏡下于各小室中隨機選取5 個視野，計數(shù)發(fā)生侵襲的細胞數(shù)，實驗重復3 次，計算細胞侵襲率（%）=下室侵襲細胞數(shù)量/細胞總數(shù)量×100%[6]。

1.4.4 WB 法檢測 HEC-1-B 細胞中 MMP-2、MMP-9 及Cyclin D1 蛋白的表達 細胞分組及處理同1.4.1，收集干預(yù)48 h 時的細胞，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，參照BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，取適量蛋白經(jīng)10%分離膠及5%濃縮膠行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜；分別加入鼠抗人MMP-2抗體（1∶250）、鼠抗人 MMP-9 抗體（1∶250）、鼠抗人 Cyclin D1 抗體（1 ∶200）與 GAPDH 一抗（1 ∶6000），4℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶共價的二抗（1∶2000）。最后于暗室中以ELC 發(fā)光試劑盒顯影，以GADPH 為參照，采用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)觀察 HEC-1-B 細胞 MMP-2、MMP-9 及Cyclin D1 蛋白 WB 染色條帶，Quantity One 1-D分析軟件進行定量，分析 MMP-2、MMP-9 及Cyclin D1 蛋白相對表達量，以目的蛋白灰度值與GAPDH 灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量[7]。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗；P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對HEC-1-B 細胞增殖抑制率的影響

低、中、高劑量實驗組HEC-1-B 細胞增殖抑制率均隨姜黃素濃度增大及作用時間延長呈逐漸升高趨勢，且組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P 均<0.05）。見表 1。

表1 姜黃素對HEC-1-B 細胞增殖抑制率的影響（，%）

表1 姜黃素對HEC-1-B 細胞增殖抑制率的影響（，%）

與低劑量實驗組比較*P<0.05；與中劑量實驗組比較#P<0.05

組別 n 24 h 36 h 48 h F 值 P 值對照組 24 - - - - -低劑量實驗組 24 14.98±2.46 26.97±2.87 39.01±3.03 442.872 <0.001中劑量實驗組 24 28.54±3.12* 41.65±3.29* 56.99±4.12* 388.968 <0.001高劑量實驗組 24 59.84±4.06*# 71.01±4.65*# 83.25±4.74*# 162.965 <0.001 F 值 - 1181.043 889.904 728.723 - -P 值 - <0.001 <0.001 <0.001 - -

2.2 姜黃素對HEC-1-B 細胞侵襲能力的影響

低、中、高劑量實驗組侵襲細胞數(shù)量及侵襲率均隨姜黃素作用濃度增大呈逐漸降低趨勢，兩兩之間比較差異均有統(tǒng)計學意義，且均低于對照組（P 均<0.05）。見表 2、圖 1。

表2 姜黃素對HEC-1-B 細胞侵襲能力的影響（）

表2 姜黃素對HEC-1-B 細胞侵襲能力的影響（）

與對照組比較▲P<0.05；與低劑量實驗組比較*P<0.05；與中劑量實驗組比較#P<0.05

組別 n 侵襲細胞數(shù)量/個 侵襲率/%對照組 3 310.81±20.12 84.25±4.95低劑量實驗組 3 221.96±14.09▲ 63.11±4.03▲中劑量實驗組 3 193.64±12.34▲* 45.03±4.21▲*高劑量實驗組 3 89.47±5.11▲*# 24.15±2.03▲*#F 值 - 127.693 125.868 P 值 - <0.001 <0.001

2.3 姜黃素對HEC-1-B 細胞 MMP-2、MMP-9及Cyclin D1 蛋白表達的影響

WB 檢測顯示，對照組、低、中、高劑量實驗組HEC-1-B 細胞 MMP-2、MMP-9 及 Cyclin D1 蛋白相對表達量均呈逐漸降低趨勢，低、中和高劑量實驗組均低于對照組，且兩兩之間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P 均<0.05）。見表3、圖2。

表 3 姜黃素對 HEC-1-B 細胞 MMP-2、MMP-9 及 Cyclin D1 蛋白表達的影響（）

表 3 姜黃素對 HEC-1-B 細胞 MMP-2、MMP-9 及 Cyclin D1 蛋白表達的影響（）

與對照組比▲P<0.05；與低劑量實驗組相比*P<0.05；與中劑量實驗組相比#P<0.05

組別 n MMP-2 MMP-9 Cyclin D1對照組 24 0.96±0.04 0.91±0.04 0.92±0.05低劑量實驗組 24 0.79±0.03▲ 0.70±0.02▲ 0.66±0.04▲中劑量實驗組 24 0.62±0.02▲* 0.49±0.03▲* 0.43±0.02▲*高劑量實驗組 24 0.37±0.03▲*# 0.24±0.01▲*# 0.31±0.02▲*#F 值 - 1600.842 2633.6 1419.755 P 值 - <0.001 <0.001 <0.001

3 討論

細胞增殖、凋亡失衡是導致惡性腫瘤形成的機制之一，其中增殖率與腫瘤生長、遷移、侵襲能力均密切相關(guān)[8-9]。近年來，諸多研究報道，姜黃素對多種腫瘤細胞的體外抗腫瘤作用顯著，且毒性低，耐受性良好。文獻[10]報道，姜黃素可通過阻礙腫瘤細胞進行正常的有絲分裂，達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。Qu 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素還可通過干擾細胞周期進程，將卵巢癌細胞周期阻滯于G2/M 期，從而誘導卵巢癌細胞凋亡。細胞增殖率是反映腫瘤生物學活性的有效指標，且增殖是腫瘤細胞發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為的基礎(chǔ)，顏泉[12]研究報道，姜黃素可抑制人骨肉瘤細胞U-2OS 和MG-63 增殖，降低其侵襲能力；劉俊香[13]研究稱，姜黃素可有效抑制非小細胞肺癌A549 細胞增殖，誘導其凋亡，并通過抑制E-cadherin、MMP-9 蛋白表達，有效削弱其侵襲能力。本研究中低/中/高劑量實驗組織增殖抑制率逐漸升高，而細胞侵襲數(shù)量、侵襲率較逐漸降低，且均低于對照組，呈現(xiàn)劑量依賴性，提示姜黃素可有效抑制子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細胞增殖，且其增殖抑制作用具有明顯時間-劑量依賴性，可有效削弱其侵襲能力，減少其惡性生物學行為。

Cyclin D1 是細胞周期啟動因子，但其表達上調(diào)時，可促進細胞周期從G1 期快速進入到S期，進而縮短細胞周期，促進細胞增殖，且羅藝洪等[14]研究報道，miR-200 b 可通過下調(diào)Cyclin D1蛋白表達及，上調(diào)p21 蛋白表達發(fā)揮抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細胞增殖的目的。細胞外基質(zhì)降解是腫瘤細胞遷移、侵襲的重要信號與途徑，其中MMP-2、MMP-9 在子宮內(nèi)膜癌惡性生物學行為中具有重要意義；楊艷等[15]研究報道，EGFR 過表達可下調(diào)子宮內(nèi)膜癌細胞MMP-2 及MMP-9 蛋白表達，抑制細胞增殖及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。目前關(guān)于姜黃素對子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細胞MMP-2、MMP-9 及Cyclin D1 蛋白表達的影響尚未見到報道。本研究中對照組、低、中、高劑量實驗組HEC-1-B 細胞 MMP-2、MMP-9 及 Cyclin D1 蛋白相對表達量均呈逐漸降低趨勢，且低/中/高劑量實驗組均低于對照組，提示姜黃素抗子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細胞增殖及侵襲的作用機制與其有效下調(diào) MMP-2、MMP-9 及 Cyclin D1 蛋白表達相關(guān)。

綜上，姜黃素對子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細胞具有顯著的增殖抑制作用，且可有效削弱其侵襲能力，其作用機制與其有效抑制MMP-2、MMP-9及Cyclin D1 蛋白表達相關(guān)，體外抗子宮內(nèi)膜癌效果顯著。姜黃素有望成為子宮內(nèi)膜癌的治療新藥，但有關(guān)其抗腫瘤效果需進一步進行體內(nèi)實驗及臨床驗證，且其具體抗腫瘤分子作用機制仍需進一步系統(tǒng)研究。