摘 要：產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens）又稱魏氏梭菌，厭氧芽孢桿菌屬。廣泛存在自然界的水源、土壤及人和動(dòng)物腸道中。它是條件致病菌，主要引起人的食物中毒、氣性壞疽和動(dòng)物猝死癥等疾病。產(chǎn)氣莢膜梭菌的重點(diǎn)檢測(cè)項(xiàng)目是活菌數(shù)的測(cè)定和證實(shí)試驗(yàn)。GB 8538-2016飲用天然礦泉水中產(chǎn)氣莢膜的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中說明，產(chǎn)氣莢膜梭菌在SPS平板上36 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h，菌落形態(tài)為黑色。但在實(shí)際檢驗(yàn)中SPS平板上的菌落形態(tài)難以呈黑色，如果改用TSC平板可以長(zhǎng)出較多黑色菌落。TSC培養(yǎng)基中檸檬酸鐵銨和亞硫酸鈉的含量比SPS要高，實(shí)驗(yàn)證明TSC培養(yǎng)基要比SPS培養(yǎng)基更能長(zhǎng)出黑色菌落。

關(guān)鍵詞：礦泉水;產(chǎn)氣莢膜梭菌;檢測(cè)方法

1 礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭菌能力驗(yàn)證遇到的問題和解決方法

2019年9月份參加礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭菌能力驗(yàn)證中遇到的問題：濾膜無黑色菌落產(chǎn)生，只有少量灰色和大量白色雜菌生長(zhǎng)。由于大量雜菌存在，導(dǎo)致確證試驗(yàn)中生化現(xiàn)象不明顯，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有通過。

2019年12月份再次參加產(chǎn)氣莢膜梭菌測(cè)量審核，綜合研究GB 4789.13-2012 和GB 8538-2016及各方資料[1-2]，制定以下實(shí)驗(yàn)方案。

按照測(cè)量審核作業(yè)指導(dǎo)書，先把凍干粉水化得到的原液，然后進(jìn)行10倍和100倍稀釋，得到稀釋液，對(duì)原液、稀釋液進(jìn)行檢測(cè)。

方法1，取50 mL樣液用0.45 μm濾膜抽濾，然后將濾膜正貼在SPS平板上，抽濾，做1個(gè)平板。

方法2，取50 mL樣液用0.22 μm濾膜抽濾，然后將濾膜正貼在SPS平板上，抽濾，共2個(gè)平板。

方法3，取50 mL樣液用0.22 μm濾膜抽濾，然后將濾膜正貼在SPS平板上，再覆蓋一層SPS培養(yǎng)基，抽濾，做1個(gè)平板。

方法4，取50 mL樣液用0.22 μm膜抽濾，然后將濾膜反貼在SPS平板上，即抽濾面朝下，抽濾，做1個(gè)平板。

方法5，取50mL樣液用0.22μm膜抽濾，然后將濾膜正貼在TSC平板上，抽濾，做1個(gè)平板。

同時(shí)做陰陽(yáng)性對(duì)照，將以上平板在（36±1）℃下厭氧培養(yǎng)24 h，結(jié)果如表1所示。

驗(yàn)證試驗(yàn)，挑取各種形態(tài)不同的菌落做生化檢驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果：

所有菌落都可以在FTG旺盛生長(zhǎng);透明白色的菌落生化指標(biāo)都不符合;灰色和黑色菌落中有部分菌的生化指標(biāo)全部符合，也有部分菌的生化指標(biāo)部分符合，可能是雜菌太多，挑取菌落時(shí)帶有雜菌。

結(jié)果報(bào)告：參考實(shí)驗(yàn)中方法2的灰色菌落（136、146灰）和方法5的黑色菌落數(shù)（173黑）的數(shù)據(jù)，報(bào)了140 CFU/50 mL，通過了驗(yàn)證。

2 結(jié)果分析

從方法1和方法5對(duì)比看，用TSC平板貼濾膜更容易長(zhǎng)出黑色菌落，更容易識(shí)別目標(biāo)菌。這是因?yàn)門SC培養(yǎng)基中檸檬酸鐵銨和亞硫酸鈉的含量比SPS高，產(chǎn)氣莢膜梭菌可以還原亞硫酸鹽為硫醚，硫醚可以與檸檬酸鐵銨反應(yīng)呈黑色。增加亞硫酸鹽的量和檸檬酸鐵銨的量，可以增強(qiáng)黑色[3]。

方法5中黑色菌落在空氣中暴露一段時(shí)間，顏色變淺，是因?yàn)楫a(chǎn)氣莢膜梭菌能將亞硫酸鹽還原為硫化物，在含亞硫酸鹽和鐵鹽的瓊脂中形成黑色菌落，遇空氣后被氧化，黑色漸漸變成灰色，所以培養(yǎng)后要盡快計(jì)數(shù)和驗(yàn)證。

從10倍稀釋液的結(jié)果看，方法1的結(jié)果是16個(gè)灰色菌落，方法2平均為18灰色菌落，結(jié)果相差不大，因此，0.45 μm的濾膜和022 μm的濾膜都可以用。

方法3和方法4中，覆蓋一層SPS培養(yǎng)基和濾膜反貼也能長(zhǎng)出黑色菌落。覆蓋一層長(zhǎng)出菌落較少，反貼濾膜不利于后續(xù)挑取菌落。

SPS和TSC上都易有較多雜菌生長(zhǎng)（TSC相對(duì)少點(diǎn)），且FTG是非選擇性增菌肉湯。所以，雜菌較多時(shí)，可先把可疑菌分離純化到TSC平板上，再將單菌落接到FTG中，最后進(jìn)行生化試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 4789.13-2012 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[2]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).GB 8538-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[3]潘寶怡，吳清平，彭飛艇，等.飲用天然礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)國(guó)標(biāo)方法的改進(jìn)[J].現(xiàn)代食品科技，2012（9）：1236-1238.

作者簡(jiǎn)介：徐萬麗（1983—），女，廣東梅州人，大專，質(zhì)量工程師。研究方向：食品檢測(cè)。