王斌，張騰霄，李艷芳，趙洪波，崔英姿

1. 綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院（綏化 152061）；2. 綏化學(xué)院食用菌研究所（綏化 152061）

中華蘆薈（Aloe veraL.var Chinesis）為百合科多年生常綠多肉草本植物，是庫(kù)拉索蘆薈的優(yōu)良變種。研究表明，蘆薈具有抗感染消炎、提高免疫力、抗腫瘤、抗胃潰瘍、護(hù)肝、保護(hù)心肌缺血、降血脂、降血糖等多種功效[1-2]。蘆薈中蒽醌化合物具有較強(qiáng)廣譜抑菌效果，且對(duì)易產(chǎn)生耐藥性的葡萄球菌和鏈球菌最為敏感[3-4]。有關(guān)蘆薈抑菌研究主要涉及臨床用藥[5-6]、畜禽養(yǎng)殖[7-9]、大田作物栽培[10]、食品防腐[11]等。金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、腸炎沙門氏菌、陰溝腸桿菌，不但引起畜禽疾病，而且是人類常見的食源性致病菌，困擾著人類的健康和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。在食品防腐中，合成防腐劑和添加劑對(duì)人體健康存在隱患，發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新型天然抗菌劑符合當(dāng)前人們健康需求。此次試驗(yàn)采用藥敏紙片法和二倍稀釋法，比較不同部位中華蘆薈皮加凝膠、凝膠的抑菌效果，為其在食品加工、防腐方面抗菌性能方面深度開發(fā)提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料、儀器與試劑

1.1 試驗(yàn)材料

由綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院王雙俠老師鑒定為中華蘆薈（Aloe veraL. var Chinesis），自家栽培6年生，產(chǎn)地黑龍江省綏化市。供試菌革蘭氏陽(yáng)性菌：金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）；革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa）、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）、陰溝腸桿菌（Enterobactercloacae），以上菌種均購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 試驗(yàn)試劑

乙醇、蒸餾水、NaCl、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、葡萄糖等均為分析純。陽(yáng)性對(duì)照品有紅霉素腸溶片（江蘇平光制藥有限責(zé)任公司）、硫酸慶大霉素膠囊（重慶迪康長(zhǎng)江制藥有限公司）、蘆薈膠制劑（蘆薈膠含96%，廣州廣德堂藥業(yè)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

HPX-9162MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；電子萬(wàn)用爐（天津市泰斯特儀器有限公司）；YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；BCD-209KHC冰箱（合肥美菱股份有限公司）；FA2104電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；KQ-50B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基制備

單增李斯特菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、腸沙門氏菌培養(yǎng)基配方：蛋白胨10.0 g、牛肉膏3.0 g、瓊脂20.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂20.0 g，H2O 1 000 mL。金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基配方：NaCl 40.0 g、牛肉膏1.5 g、蛋白胨5.0 g、瓊脂10.0 g，蒸餾水500 mL。陰溝腸桿菌培養(yǎng)基配方：牛肉膏5.0 g、蛋白胨5.0 g、NaCl 2.5 g、葡萄糖5.0 g、瓊脂10.0 g，蒸餾水500 mL。上述培養(yǎng)基配置好后分裝，于121 ℃滅菌20 min，超凈工作臺(tái)內(nèi)倒平板，備用。

2.2 菌懸液制備

從冰箱（4 ℃）中取出6種供試菌，分別轉(zhuǎn)接在相應(yīng)平板培養(yǎng)基上，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的菌落分別用接種環(huán)刮取兩三環(huán)，放入裝有滅菌生理鹽水錐形瓶中，置于搖床（200 r/min）上，振搖10 min，按麥?zhǔn)媳葷峁芊▽⒕鷳乙旱木鷿舛认♂尀?×106CFU/mL，置超凈工作臺(tái)中備用。

2.3 樣品液制備

表1 樣品編號(hào)

滅菌水清洗中華蘆薈、研缽、剪刀、鑷子等材料和工具，再用75%的酒精棉球擦拭。稱取中華蘆薈老葉、中葉、嫩葉的皮加凝膠（外皮與中部凝膠）及凝膠（葉片中部凝膠），各10 g，平行3次，充分研磨，得樣品原液。無(wú)菌水分別進(jìn)行稀釋得75%，50%和25%樣品液，置超凈工作臺(tái)中備用。樣品編號(hào)見表1。

2.4 藥敏紙片法抑菌試驗(yàn)

在超凈工作臺(tái)中，分別用移液槍吸取0.2 mL不同菌懸液，均勻涂布于相應(yīng)培養(yǎng)基平板上。將無(wú)菌濾紙片在樣品液中浸泡0.5 h。用無(wú)菌鑷子夾取濾紙片，淋掉多余液體，使濾紙片與培養(yǎng)基密切接觸。每個(gè)培養(yǎng)平板均勻放置4張濾紙片。滅菌生理鹽水為陰性對(duì)照，抗生素（紅霉素標(biāo)記H、硫酸慶大霉素標(biāo)記Q、氯霉素標(biāo)記L）及蘆薈膠制劑（標(biāo)記Y）為陽(yáng)性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照所用的抗菌藥品及濃度，針對(duì)各種試驗(yàn)菌種通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定，蘆薈膠制劑稀釋成與樣品液相同的4個(gè)濃度。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h。測(cè)定其抑菌圈直徑，以毫米（mm）為單位，平行3次，抑菌圈直徑用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件。

2.5 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

采用二倍稀釋法，參照文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行測(cè)定。2.3制備的蘆薈樣品原液以有效成分為1.0 g/mL計(jì)，用液體培養(yǎng)基將各蘆薈樣品原液稀釋成二倍比的系列，使各管質(zhì)量濃度分別為0.50，0.25，0.125，0.062 5，0.031 3，0.015 6，0.007 8，0.003 9，0.002 0和0.001 0 g/mL，再向各管中加入0.1 mL含1×106CFU/mL的菌懸液，試管置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀測(cè)MIC。

3 結(jié)果與分析

3.1 抑菌預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

由預(yù)試驗(yàn)可知，中華蘆薈對(duì)陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌無(wú)明顯抑菌效果。陽(yáng)性對(duì)照抗生素濃度篩選結(jié)果表明，0.13 mg/mL紅霉素（H）為金黃色葡萄球菌陽(yáng)性對(duì)照效果較好，5 mg/mL氯霉素（L）為單增李斯特菌的陽(yáng)性對(duì)照效果較好，0.8 mg/mL硫酸慶大霉素（Q）為革蘭氏陰性菌陽(yáng)性對(duì)照效果較好。

3.2 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表2～表5，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均符合統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。中華蘆薈樣品液濃度越高，抑菌效果越明顯；中華蘆薈皮加凝膠樣品液的抑菌效果明顯高于凝膠的抑菌效果。中華蘆薈皮加凝膠對(duì)單增李斯特菌抑菌活性與蘆薈膠制劑接近，抑菌活性略低于氯霉素陽(yáng)性對(duì)照。中華蘆薈皮加凝膠對(duì)大腸桿菌抑菌活性與蘆薈膠制劑接近，抑菌活性略低于慶大霉素陽(yáng)性對(duì)照；中華蘆薈中葉對(duì)大腸桿菌抑菌效果明顯高于嫩葉和老葉。結(jié)合相關(guān)研究文獻(xiàn)表明，蒽醌類化合物和凝膠多糖是蘆薈發(fā)揮抗菌作用的有效成分，且蒽醌類化合物的抗菌活性大于凝膠多糖，由于蒽醌類化合物主要積累于蘆薈外皮中[3]，因此同葉齡中華蘆薈皮加凝膠的抑菌效果明顯優(yōu)于凝膠的抑菌效果。

表2 金黃色葡萄球菌抑菌效果 mm

表3 單增李斯特菌抑菌效果 mm

表4 大腸桿菌抑菌效果 mm

表5 腸炎沙門氏菌菌抑菌效果 mm

3.3 最小抑菌濃度

結(jié)果表明：不同葉齡、不同部位中華蘆薈對(duì)供試菌的抑菌活性存在差別，低濃度的蘆薈樣品對(duì)單增李斯特菌和大腸桿菌產(chǎn)生抑制作用，其最小抑菌質(zhì)量濃度分別為0.015 6和0.007 8 g/mL。而腸炎沙門氏菌對(duì)蘆薈樣品敏感度低，只有高濃度樣品才能發(fā)揮抑菌作用。

4 結(jié)論

中華蘆薈對(duì)單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸沙門氏菌有明顯抑菌作用，對(duì)銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌無(wú)明顯抑菌作用。中華蘆薈樣品液濃度越高抑菌效果越好，中華蘆薈嫩葉、中葉、老葉的抑菌效果有差別。中華蘆薈皮加凝膠部位對(duì)被試菌的敏感強(qiáng)弱順序依次為：大腸桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、腸沙門氏菌。中華蘆薈凝膠部位對(duì)被試菌的敏感強(qiáng)弱順序依次為：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、腸沙門氏菌。蘆薈具有較強(qiáng)抗菌性、不產(chǎn)生耐藥性、低毒低害等優(yōu)點(diǎn)，具有成為新型天然抗菌劑的巨大潛力。今后在深度開發(fā)中華蘆薈對(duì)單增李斯特菌和大腸桿菌抑菌性能時(shí)，結(jié)合生物學(xué)產(chǎn)量，建議選用中華蘆薈中葉皮加凝膠部位。