趙子涵，王姿曼，鄧岳文,2，楊創(chuàng)業(yè),2，李俊輝

大珠母貝胰島素相關(guān)肽受體基因的克隆與表達(dá)

趙子涵1，王姿曼1，鄧岳文1,2，楊創(chuàng)業(yè)1,2，李俊輝1

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 // 2. 廣東省珍珠科技創(chuàng)新中心，廣東 湛江 524025）

【】克隆大珠母貝（）胰島素相關(guān)肽受體基因，并分析其在不同組織中的表達(dá)。利用cDNA快速末端克隆技術(shù)（RACE）獲得大珠母貝基因cDNA全長序列。熒光定量PCR技術(shù)分析在閉殼肌、鰓、外套膜邊緣區(qū)、套膜區(qū)、中央?yún)^(qū)、足和肝胰腺等組織的表達(dá)模式?！尽炕蛉L6 009 bp，5′非編碼區(qū)（UTR）615 bp、3′UTR 764 bp、開放閱讀框（ORF）長4 629 bp、編碼 1 542個氨基酸。序列分析表明，含有保守結(jié)構(gòu)域Fu、3個FNⅢ結(jié)構(gòu)域和Tyrkc結(jié)構(gòu)域，并含有信號肽和2個跨膜結(jié)構(gòu)域。在大珠母貝各個組織存在差異表達(dá)，在鰓、肝胰腺和外套膜邊緣區(qū)中顯著高表達(dá)。

大珠母貝；胰島素肽相關(guān)受體；基因克??；表達(dá)模式

胰島素樣家族是動物生長、發(fā)育和代謝的重要調(diào)節(jié)因子，通過與酪氨酸激酶受體（胰島素受體）結(jié)合，在傳遞跨膜信息和調(diào)節(jié)細(xì)胞功能方面發(fā)揮重要作用，參與許多生命活動[1-2]。胰島素相關(guān)受體（）是胰島素受體（）家族的成員，作為細(xì)胞表面受體，是參與調(diào)節(jié)體內(nèi)酸堿平衡的細(xì)胞外堿性介質(zhì)代謝傳感器，在腎、胃和胰腺的某些細(xì)胞群中表達(dá)[3-4]。脊椎動物有不止一個同源的胰島素受體家族成員，而無脊椎動物只有一個胰島素相關(guān)肽受體（），這個單一的調(diào)節(jié)無脊椎動物的生長和代謝[1,5]。胰島素相關(guān)肽及其受體已在許多軟體動物中報道，Hamano等[6]在太平洋牡蠣中鑒定分離了胰島素相關(guān)肽基因，并分析其結(jié)構(gòu)和表達(dá)。在太平洋牡蠣中，胰島素系統(tǒng)調(diào)控外套膜生長和殼形成有關(guān)的內(nèi)外上皮細(xì)胞水平，還可通過餌料調(diào)控整合環(huán)境條件的變化[7-8]。馬氏珠母貝（）中胰島素相關(guān)肽受體（）與人重組胰島素樣生長因子I（）相互作用，并刺激了卵母細(xì)胞的MAPK和PI3K信號通路調(diào)節(jié)糖原代謝[4]。Lardans等[9]也探討了曼氏血吸蟲幼蟲共培養(yǎng)類胰島素受體（）在曼氏血吸蟲幼蟲胚胎細(xì)胞的激活和增殖過程中的可能意義。

大珠母貝（）自然分布在澳大利亞、菲律賓、馬來西亞、印度尼西亞等熱帶亞熱帶國家沿海地區(qū)，在我國廣東省、廣西省和海南省也有分布，是我國南方海水養(yǎng)殖珍珠貝類的重要組成部分之一，主要用于生產(chǎn)大規(guī)格珍珠[10-11]。目前大珠母貝產(chǎn)業(yè)主要問題為養(yǎng)殖期間苗種成活率偏低，無法為商業(yè)化生產(chǎn)提供足量母貝[12]。通過品種培育與養(yǎng)殖技術(shù)研究，能明顯提高養(yǎng)殖成活率。本實驗利用RACE技術(shù)克隆了基因的全長序列，并通過熒光定量PCR技術(shù)檢測了在不同組織的表達(dá)模式，為進(jìn)一步了解在大珠母貝中生長作用提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用貝取自湛江市徐聞縣承梧村海區(qū)，挑選無病害的2齡大珠母貝，剪取閉殼?。ˋ）、鰓（GI）、外套膜邊緣區(qū)（ME）、套膜區(qū)（MP）、中央?yún)^(qū)（MC）、足（F）和肝胰腺（HE），所取組織放入液氮速凍，存于-80 ℃超低溫冰箱，用于熒光定量分析。

RNA提取試劑Trizol，SMARTer TMRACEcDNA Amptification kit，SYBR Premix ExTaqTM購自Thermo Fisher Scientific公司，Reverse Transcriptase M-MLV (RnaseH)、rTaq和Primerstar DNA聚合酶、PDM-19T載體購自Takala Bio公司。

1.2 PmIRR基因全長的克隆

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 用Trizol提取法提取大珠母貝組織總RNA，利用NanoDropND1000紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。5′RACE和3′RACE模板的獲得參考SMARTerTM RACE cDNA Amolification Kit[13]。

1.2.2序列全長獲取 根據(jù)大珠母貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的unigene序列設(shè)計基因特異性引物，將該基因中間分為三段克隆。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用純化回收試劑盒對目的片段進(jìn)行純化回收。目的片段通過PDM-19T載體連接，然后轉(zhuǎn)入DH5a 感受態(tài)細(xì)胞中。通過LA（含氨芐青霉素 Amp+）固體平板篩選出陽性菌落，挑選單克隆[14]，送至廣州生工生物工程有限公司測序。利用5′端和3′端巢式引物進(jìn)行擴(kuò)增。目的片段的回收、轉(zhuǎn)化、測序等方法同基因中間片段，然后將5′端和3′端拼接獲得全長序列（表1）。

1.3 PmIRR組織差異表達(dá)

用熒光定量PCR檢測基因在邊緣膜、套膜、中央膜、閉殼肌、腮、肝胰腺、足組織中的表達(dá)模式。以為內(nèi)參基因，配置10 μL反應(yīng)體系：10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，滅菌的ddH2O 3.8 μL，cDNA0.4 μL，SYBR? Select Master Mix 5 μL反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性 5 min，95 ℃下變性 10 s，60 ℃下退火15 s，72 ℃延伸15 s，40循環(huán)，添加 1 個溶解曲線。每個樣品重復(fù) 3 次。用2-△△Ct法計算基因在各組織中的相對表達(dá)量。通過SPSS19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，= 0.05[13]。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN將中間片段、3′端序列和5′序列拼接起來，獲得cDNA全長序列。用在線分析工具ORF Finder 分析開放閱讀框（ORF）并推導(dǎo)出基因的氨基酸序列，用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)分析氨基酸序列的理化性質(zhì)，運(yùn)用在線工具SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測其信號肽。SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測PmIRR的保守結(jié)構(gòu)域，用TMHMM Server, v.2.0推測其跨膜結(jié)構(gòu)域，用SOPMA（https://npsa- prabi. ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）推測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。用MEGA6構(gòu)建PmIRR進(jìn)化樹。用ClusterW2與其它已知物種相應(yīng)的IRR氨基酸序列進(jìn)行同源性對比。

表1 引物序列

Table 1 Sequences and functions of primers

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆與特征分析

克隆得大珠母貝cDNA全長序列。結(jié)果顯示，序列全長6 009 bp，其中 5′UTR 為615 bp；3′UTR 為764 bp，包含28 bp的ployA；ORF為4 629 bp，編碼1 542個氨基酸（圖1）。經(jīng)預(yù)測PmIRR有一個信號肽位點(diǎn)（27 ~ 28 bp），為分泌蛋白（圖2）。兩個跨膜結(jié)構(gòu)域位于12-34bp和1005-1027bp，該分子屬于膜蛋白（圖3）。SMART預(yù)測其有1個（Fu）結(jié)構(gòu)域、3個（FN3）結(jié)構(gòu)域和1個（Tyrkc）結(jié)構(gòu)域（圖4）。

小寫字母和大寫字母分別表示非編碼區(qū)和編碼區(qū)；加粗字體為起始密碼子和終止密碼子；雙下劃線的字母表示信號肽；斜體部分表示跨膜結(jié)構(gòu)域；陰影部分表示Fu結(jié)構(gòu)域；單劃線為FN3結(jié)構(gòu)域；方框內(nèi)為Tyrkc結(jié)構(gòu)域

圖1基因的 cDNA 序列及編碼的氨基酸序列

Fig. 1cDNA and amino acid sequence of

圖2 PmIRR信號肽序列

圖3 PmIRR跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

圖4 PmIRR蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

2.2 PmIRR蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

預(yù)測得PmIRR理論分子質(zhì)量為75.3 ku；等電點(diǎn)為6.49；負(fù)電荷殘基202個，正電荷殘基192個。氨基酸含量分析結(jié)果顯示，其脂溶指數(shù)（Aliphatic index）為75.89；總平均親水性（Grand averageofhydropathy, GRAVY）為 – 0.531，屬于親水性蛋白（圖5）。經(jīng)預(yù)測，PmIRR的二級結(jié)構(gòu)中，α 螺旋結(jié)構(gòu)占整體的25.36%，延伸鏈占18.48%，β 轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占4.67%，無規(guī)則折疊占51.49%（圖6）。

圖5 PmIRR蛋白疏水性

圖6 PmIRR蛋白二級結(jié)構(gòu)

2.3 同源對比與進(jìn)化樹分析

將美洲牡蠣（）、太平洋牡蠣（）、馬氏珠母貝（）和蝦夷扇貝（）的Tyrkc結(jié)構(gòu)域進(jìn)行同源性對比（圖7），發(fā)現(xiàn)大珠母貝PmIRR的Tyrkc結(jié)構(gòu)域與這些物種的Tyrkc結(jié)構(gòu)域相似度較高，說明IRR氨基酸序列有較高保守性。構(gòu)建PmIRR與其他物種IRR的進(jìn)化樹（圖8），發(fā)現(xiàn)與雙殼貝類聚為一支，跟親緣性最近，與節(jié)肢類動物親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

深藍(lán)色表示一致；粉色表示強(qiáng)相似性；藍(lán)色表示弱相似性

圖8 鄰接法構(gòu)建的PmIRR家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 PmIRR基因組織表達(dá)模式分析

結(jié)果顯示，在各個組織中均有表達(dá)，其中在鰓、肝胰腺、邊緣膜等組織表達(dá)量較高，在閉殼肌和足中表達(dá)量較低（圖9）。

ME，邊緣膜；MP，套膜區(qū)；MC，中央膜；A，閉殼??；GI，鰓；HE，肝胰腺；F，足； 無共同字母（a、b、c）表示差異顯著(P < 0.05)；凡含一個相同字母者表示差異不顯著（P > 0.05）

3 討論

胰島素相關(guān)肽基因及受體在一些軟體動物中已有報道，已被證明對生物的生長和發(fā)育有重要意義[9,15-17]。為了解胰島素相關(guān)肽受體基因在大珠母貝生長中的作用，本實驗利用RACE技術(shù)在大珠母貝中克隆得到胰島素相關(guān)肽受體基因的cDNA全長序列。分析發(fā)現(xiàn)，該基因氨基酸序列包含1個Tyrkc結(jié)構(gòu)域、3個FN3結(jié)構(gòu)域和1個Fu結(jié)構(gòu)域，多序列比對結(jié)果表明其Tyrkc結(jié)構(gòu)域與其他物種的Tyrkc結(jié)構(gòu)域比對結(jié)果呈現(xiàn)較高的保守性。Tyrkc結(jié)構(gòu)域為酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域在信號傳遞中發(fā)揮重要作用[18-19]。Fu結(jié)構(gòu)域能識別特定氨基酸序列，激活重要的多肽和蛋白的前體[20-21]，可能跟IRR的信號傳導(dǎo)機(jī)制有關(guān)。有報道稱纖維連接蛋白III型FN3結(jié)構(gòu)域是受體的堿敏感特性的重要區(qū)域[22-24]。此外，發(fā)現(xiàn)IRR有兩個典型的Recep-L-domain結(jié)構(gòu)域，為酪氨酸激酶受體小家族的典型結(jié)構(gòu)域。因此可能發(fā)揮胰島素相關(guān)肽受體的功能。

為進(jìn)一步探究在大珠母貝中的功能，本研究通過熒光定量PCR技術(shù)檢測其在大珠母貝不同組織中的表達(dá)模式，結(jié)果顯示，在所檢測的7個組織中均有表達(dá)。其中，在鰓組織中顯著高表達(dá)，其次是肝胰腺和外套膜邊緣區(qū)。在這些特定組織中的高表達(dá)現(xiàn)象，表明其可能參與機(jī)體的能量代謝。在貝類中，鰓組織是呼吸和濾食的主要器官[25]。研究發(fā)現(xiàn)胰島素相關(guān)肽()在縊蟶鰓組織中有非常高的表達(dá)量，提示胰島素相關(guān)肽可能參與肝糖代謝調(diào)控或鰓的再生[26-28]。因此，推測參與大珠母貝鰓組織糖原代謝或細(xì)胞再生的調(diào)控通路。肝胰腺是貝類重要消化和代謝器官[29]，在肝胰腺中高表達(dá)可能與其能量代謝的功能相關(guān)[5,31]。在外套膜不同區(qū)域呈中等表達(dá)水平，這與牡蠣[8]的研究結(jié)果類似。之前研究已證實外套膜與貝殼的形成有關(guān)[32-33]。馬氏珠母貝中存在胰島素相關(guān)肽及受體調(diào)控通路來調(diào)節(jié)貝殼的生長和發(fā)育[34]，表明很可能參與大珠母貝貝殼的生長。郝瑞娟等[35]探究大珠母貝不同步生長代謝機(jī)制，確定了雙殼類不同步生長中的一些代謝途徑和代謝產(chǎn)物。在調(diào)控大珠母貝生長發(fā)育的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語

本實驗從大珠母貝中克隆獲得胰島素肽相關(guān)受體()基因cDNA全長序列，發(fā)現(xiàn)該基因在大珠母貝鰓、肝胰腺、外套膜邊緣區(qū)表達(dá)量相對較高，可能參與大珠母貝貝殼的生長和機(jī)體組織發(fā)育等生理功能。本研究為進(jìn)一步探究在大珠母貝中的生理功能提供基礎(chǔ)資料。

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Gene Cloning and Expression Pattern Analysis of Insulin-related Peptide Receptor from

ZHAO Zi-han1, WANG Zi-man1, DENG Yue-wen1,2, YANG Chuang-ye1,2, LI Jun-hui1

（1.//2,524088,）

【】The insulin-related peptide receptor () gene ofwas cloned and its expression patterns in various tissues were analyzed.【】The full-length cDNA sequence ofwas cloned by rapid amplification of cDNA ends (RACE) and the tissue expression pattern of this gene was determined by RT-PCR. 【】The full-length ofwas 6 009 bp. It consist of a 5′UTR (615 bp), a 3′UTR (764 bp) and an open reading frame (4 627 bp) which encoded for 1542 amino acids. d Amino acids analysis of PmIRR showed that it contained a conservative domain Fu, three FNIII domains, a tyrkc domains, a signal peptide and two transmembrane domains.was differentially expressed in different tissues of, and the expression was significantly higher in gills, hepatopancreas and mantle edge.

; insulin-related peptide receptor; gene cloning; expression pattern

Q78; Q959.215+.4

A

1673-9159（2020）05-0034-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.005

2020-04-09

農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(CARS-49)；廣東省教育廳珍珠研究創(chuàng)新團(tuán)隊（2017KCXTD016）；廣東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊專項（2019KJ146）

趙子涵（1996－），女，碩士研究生，研究方向：珍珠培育與加工。E-mail：1922754931@qq.com

鄧岳文（1975－），教授，主要從事珍珠貝遺傳育種與養(yǎng)殖研究。E-mail：dengyw@gdou.edu.cn

趙子涵，王姿曼，鄧岳文，等. 大珠母貝胰島素相關(guān)肽受體基因的克隆與表達(dá)[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2020，40（5）：34-42.

（責(zé)任編輯：劉嶺）