張志強(qiáng)，劉鑫潮，牛金中，黃 瑜，王 蓓，簡(jiǎn)紀(jì)常

尼羅羅非魚基因的原核表達(dá)及誘導(dǎo)條件優(yōu)化

張志強(qiáng)，劉鑫潮，牛金中，黃 瑜，王 蓓，簡(jiǎn)紀(jì)常

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 // 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 // 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

【】研究尼羅羅非魚（）基因（記作）的原核表達(dá)，為大量獲取尼羅羅非魚Galectin-4蛋白（OnGal-4）和后續(xù)功能研究奠定基礎(chǔ)。根據(jù)NCBI上公布的尼羅羅非魚基因序列（Genbank：XM-019345120）設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)Galectin-4重組蛋白（rOnGal-4）在BL21原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，并優(yōu)化其誘導(dǎo)條件。成功擴(kuò)增出基因，并構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-OnGal-4。rOnGal-4最佳誘導(dǎo)條件是溫度28 ℃，IPTG濃度0.4 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間4 h。在此條件下，rOnGal-4在可溶性蛋白中大量表達(dá)。Western-blot結(jié)果顯示，rOnGal-4可與抗GST標(biāo)簽的單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。

尼羅羅非魚；Galectin-4；基因克?。辉吮磉_(dá)；條件優(yōu)化

尼羅羅非魚（）是一種重要的世界性經(jīng)濟(jì)魚類，在我國(guó)南方廣泛養(yǎng)殖[1-2]。無乳鏈球菌（）為羅非魚病原體之一，常會(huì)引起羅非魚患病死亡，近年來給我國(guó)和世界羅非魚養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。為有效控制疾病的發(fā)生與傳播，了解與深入研究羅非魚自身免疫系統(tǒng)尤為重要。

半乳糖凝集素（Galectin）是一類能與β-半乳糖苷特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，有調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、細(xì)胞-基質(zhì)黏附和跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理功能[5]，可識(shí)別微生物的非自身多糖，被認(rèn)為是模式識(shí)別受體(Pattern Recognition Receptor)，可調(diào)節(jié)病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-AssociatedMolecular Pattern) 激活的天然免疫過程[6]。迄今已鑒定出15種哺乳動(dòng)物Galectin[7]，其中Galectin-4有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡以及通過穩(wěn)定黏附連接復(fù)合物而促進(jìn)細(xì)胞黏附等功能[8]，還可通過單核細(xì)胞的激活和分化發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[9]，在病原體識(shí)別、T細(xì)胞凋亡和NK細(xì)胞活化中發(fā)揮重要作用[10-11]。Galectin-4基因已在人類和小鼠中有相關(guān)研究[12-13]，但有關(guān)硬骨魚類中Galectin-4基因的報(bào)道僅見于線鱧（）和大菱鲆（）[14-15]，Galectin-4在大菱鲆腸道中的表達(dá)水平最高，而在皮膚中的表達(dá)水平最低，另外，用鰻弧菌（）和海豚鏈球菌（）攻毒后，其表達(dá)量在腸道中顯著下調(diào)[15]。表明Galectin-4在魚類腸道抵抗感染的免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，但目前對(duì)于Galectin-4在尼羅羅非魚中的研究還未見報(bào)道。本研究通過克隆獲得尼羅羅非魚Galectin-4基因（）的開放閱讀框（ORF）全長(zhǎng)，構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-OnGal-4，同時(shí)對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化，為大量獲取尼羅羅非魚Galectin-4重組蛋白（rOnGal-4）和研究該蛋白在尼羅羅非魚免疫系統(tǒng)中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

羅非魚購自廣東省湛江市東風(fēng)水產(chǎn)品市場(chǎng)。pMD18-T載體、rTaq酶、DNA Maker、T4連接酶、R I和I，TaKaRa公司。總RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TRANS公司。彩虹Maker和GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，碧云天公司。質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒，Thermo Fisher公司。大腸桿菌DH5a和BL21感受態(tài)細(xì)胞采用超級(jí)感受態(tài)試劑盒制作。原核表達(dá)載體pGEX-4T（+）Vector由本實(shí)驗(yàn)室保存。引物合成與菌液測(cè)序由生工生物股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1基因的擴(kuò)增 剖取尼羅羅非魚的頭腎，在無RNA酶的環(huán)境中提取尼羅羅非魚的總RNA。將檢測(cè)合格(瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果為條帶單一) 的尼羅羅非魚總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明書將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板。根據(jù)NCBI上預(yù)測(cè)的尼羅羅非魚基因的ORF全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，引物序列為Gal4-R：CTTTG TTGCTCCTCCTGGC（R I）、Gal4-F：TAAGAA TAGAGAAGTGGATGTAGGAGAT（I）。以尼羅羅非魚頭腎的cDNA為模板，采用20 μL體系（Extaq Mix 10 μL、滅菌水7.5 μL、Gal4-R 1 μL、Gal4-F 1 μL、cDNA 0.5 μL）進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 70 s，循環(huán)36次；72 ℃下終延伸10 min。擴(kuò)增得到目的條帶后，用pMD18-T載體與純化回收產(chǎn)物在16 ℃連接30 min。取50 μL大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，加入4 μL連接產(chǎn)物，混勻，冰浴20 min，42 ℃水浴鍋中熱激90 s，即刻置冰上冰浴2 min；加400 μL LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)45 ~ 60 min；取50 ~100 μL涂在LA（帶有Amp+的LB）瓊脂培養(yǎng)板上，于37 ℃下倒置培養(yǎng)12 h。挑取單菌落用通用引物M13、RV進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性菌落送去公司測(cè)序。

1.2.2基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 對(duì)測(cè)序正確的菌液和pGEX-4T（+）空載菌種提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒在37 ℃下雙酶切30 min，純化回收酶切后的目的片段。用T4連接酶將回收的目的片段與載體片段于4 ℃下連接10 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)中，方法同1.2.1。采用pGEX4T(F)、pGEX4T(R) 進(jìn)行菌落PCR鑒定，選取陽性克隆菌測(cè)序。對(duì)測(cè)序吻合的菌液提取質(zhì)粒，并將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)，用LA液體培養(yǎng)基在37 ℃搖床培育3 ~ 5 h。

1.2.3 rOnGal-4的誘導(dǎo)表達(dá) 待菌液的OD600值達(dá)到0.5時(shí)，取部分菌液在超凈臺(tái)用體積分?jǐn)?shù)50%甘油保種，置于? 80 ℃冰箱保存，剩余部分用錐形瓶分裝為兩瓶。在其中一瓶中加入異丙基---硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度1 mmol/L，另一瓶不加IPTG，兩瓶菌液均置于18 ℃、120 r/min的搖床誘導(dǎo)9 h。收集誘導(dǎo)菌液和未誘導(dǎo)菌液各2 mL，以12 000 r/min離心，棄上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸3次，加入PBS重懸菌液50 μL，蛋白上樣緩沖液10 μL，混勻。于100 ℃水中煮沸5 min，離心，取上清液（全菌蛋白）進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.4 rOnGal-4表達(dá)條件優(yōu)化 在蛋白可成功表達(dá)的前提下，采取單一變量控制法對(duì)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行逐一優(yōu)化。比較rOnGal-4在IPTG濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間分別為0、1、2、3、4、5、6、7 h，誘導(dǎo)溫度分別為18、28、37℃下的表達(dá)情況，篩選出最佳誘導(dǎo)條件。

1.2.5 rOnGal-4的純化及Western blot鑒定 最佳誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)rOnGal-4，然后收集誘導(dǎo)的菌液，進(jìn)行超聲破碎，在4℃、8 000 r/min條件下離心40 min，取上清液通過GST鎳柱層析法純化蛋白。取所得蛋白兩份進(jìn)行SDS-PAGE電泳，一份染色鑒定，同時(shí)將另一份用半干法轉(zhuǎn)膜（5.5 mA 10 min）到PVDF膜上，于4 ℃下用含有50 mg/mL脫脂奶粉的TBST封閉10 h。先用鼠抗GST多克隆抗體（1∶5 000稀釋）室溫條件下孵育2 h，再用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgM（1∶5000稀釋）以室溫條件孵育1 h，用超敏快速Western blot檢測(cè)試劑盒顯色檢測(cè)，拍照。

2 結(jié)果

2.1 OnGal-4基因的PCR擴(kuò)增和鑒定

PCR擴(kuò)增獲得一1 194 bp的條帶（圖1），條帶大小與目的片段的ORF全長(zhǎng)相符。將擴(kuò)增片段和pMD-18T載體相連，轉(zhuǎn)化，涂板，挑菌，用通用引物M13和RV鑒定單菌落，得到一1 354 bp的條帶（圖1），表明該菌落為陽性克隆。將陽性克隆菌落送去測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示插入pMD-18T載體的片段與目的片段完全一致。

M1、M2，DL2000 DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；1、2，引物Gal4-R、Gal4-F擴(kuò)增產(chǎn)物；3、4、5，引物M13和RV擴(kuò)增產(chǎn)物

M1 and M2, DNA molecular Marker DL2000; 1 and 2, PCR amplification products by using Gal4-R and Gal4-F primers; 3, 4 and 5, PCR amplification products by using M13 and RV primers

圖1基因PCR擴(kuò)增和鑒定

Fig. 1 Cloning and identification ofgene

2.2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-OnGal-4的酶切鑒定

重組質(zhì)粒pGEX-4T-OnGal-4雙酶切后，在1 194 bp處得一段酶切產(chǎn)物，該酶切產(chǎn)物與基因的分子大小相同，并在4 969 bp處發(fā)現(xiàn)與pGEX-4T空載大小一致的條帶（圖2）。對(duì)質(zhì)粒測(cè)序后，結(jié)果顯示成功插入該載體。

M1、M2，DL10000 DNA、DL2000 DNA 分子標(biāo)準(zhǔn)；1、2，重組質(zhì)粒雙酶切的產(chǎn)物

2.3 rOnGal-4原核表達(dá)鑒定

rOnGal-4的原核表達(dá)鑒定結(jié)果（圖3）顯示，rOnGal-4誘導(dǎo)后在68 ku處出現(xiàn)一明顯條帶，而未誘導(dǎo)的rOnGal-4在68 ku處并未出現(xiàn)明顯條帶，表明該蛋白誘導(dǎo)表達(dá)獲得成功。同時(shí)誘導(dǎo)pGEX-4T空載發(fā)現(xiàn)GST標(biāo)簽蛋白大小為26 ku，因此，誘導(dǎo)的rOnGal-4大小為42 ku，與預(yù)測(cè)的目標(biāo)蛋白大小相同。

M，蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；1、2，未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后的pGEX-4T；3、4，未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后的rOnGal-4

2.4 rOnGal-4表達(dá)條件優(yōu)化

2.4.1 rOnGal-4誘導(dǎo)物濃度優(yōu)化 誘導(dǎo)物IPTG濃度優(yōu)化結(jié)果（圖4）表明，rOnGal-4的表達(dá)量隨IPTG濃度的升高呈現(xiàn)先增加再保持平穩(wěn)最后下降的趨勢(shì)，當(dāng)IPTG濃度達(dá)到0.4 mmol/L時(shí)，rOnGal-4表達(dá)量達(dá)到最大。再增加IPTG濃度rOnGal-4表達(dá)量不會(huì)明顯增加；但當(dāng)其濃度達(dá)到1.2 mmol/L時(shí)，rOnGal-4表達(dá)量反而會(huì)減少。因此，確定其誘導(dǎo)物IPTG的最佳濃度是0.4 mmol/L。

M，蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；1，未誘導(dǎo)的rOnGal-4；2-7，IPTG誘導(dǎo)濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L

2.4.2 rOnGal-4誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化 誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果顯示在IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度一定時(shí)，rOnGal-4表達(dá)量在一定范圍內(nèi)會(huì)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，但當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間達(dá)到4 h后再延長(zhǎng)時(shí)間其表達(dá)量無明顯增加（圖5），由此確定rOnGal-4的最佳誘導(dǎo)時(shí)間是4 h。

M，蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；1-8，誘導(dǎo)時(shí)間濃度分別為0、1、2、3、4、5、6、7 h

2.4.3 rOnGal-4誘導(dǎo)溫度優(yōu)化 圖6表明，在IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間一定時(shí)，不同溫度條件對(duì)rOnGal-4在可溶性蛋白及包涵體蛋白中的表達(dá)量均有一定影響。在28℃誘導(dǎo)時(shí)rOnGal-4的可溶性蛋白和包涵體蛋白表達(dá)量最高，在37 ℃誘導(dǎo)時(shí)其可溶性蛋白的表達(dá)量最低。同時(shí)對(duì)rOnGal-4可溶性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，其在包涵體蛋白中的表達(dá)量較高，但是由于可溶性蛋白較易獲得且不會(huì)對(duì)蛋白活性有較多的損傷，更有利于后續(xù)試驗(yàn)的開展，所以確定rOnGal-4最佳誘導(dǎo)溫度是28 ℃。

M，蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；1、3、5，18、28、37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)的可溶性蛋白；2、4、6，18、28、37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)的包涵體蛋白

2.5 rOnGal-4純化鑒定和western bolt鑒定

在上述優(yōu)化得到的最佳誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)rOnGal-4。誘導(dǎo)過的rOnGal-4全菌蛋白、可溶性蛋白和純化后rOnGal-4的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果（圖7A）顯示，在68 ku處均有條帶且純化后的rOnGal-4呈現(xiàn)單一條帶，表明蛋白純化成功。對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行Western bolt驗(yàn)證，結(jié)果顯示為單一條帶（圖7B）。

A, SDS-PAGE鑒定; B, Western bolt鑒定; M, 蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；1, 未誘導(dǎo)的rOnGal-4；2、3, 誘導(dǎo)后rOnGal-4的全菌蛋白、可溶性蛋白；4、5, 純化后的rOnGal-4

A, identification by SDS-PAGE; B, identification by Western bolt;

M, Protein molecular Marker; 1, rOnGal-4 without inducing; 2 and 3, The whole and Soluble protein of rOnGal-4 after induction; 4 and 5, Purified rOnGal-4 protein

圖7 純化后rOnGal-4的鑒定

Fig. 7 Identification for the purified rOnGal-4

3 討論

原核系統(tǒng)具有在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的重組蛋白、簡(jiǎn)單而廉價(jià)的細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)以及眾所周知的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制，基因修飾的簡(jiǎn)便性和許多細(xì)菌突變體的可用性等優(yōu)點(diǎn)，因而在研究中被廣泛應(yīng)用[17]。為獲得大量的重組蛋白，本研究選用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，并選用目前調(diào)節(jié)T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性最有效的分子誘導(dǎo)劑IPTG作為誘導(dǎo)劑[18]。因原核表達(dá)效果會(huì)受諸多表達(dá)元件和外界條件的影響[19]，故對(duì)其誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，在IPTG濃度為0.4 mmol/L時(shí)rOnGal-4表達(dá)量最大。羅氏沼蝦雌激素相關(guān)受體() 基因[20]、哈維氏弧菌基因[21]等的原核表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果顯示，IPTG濃度應(yīng)在0.1 ~ 0.8 mmol/L范圍，與本研究結(jié)果一致。IPTG濃度為1.2 mmol/L時(shí)蛋白表達(dá)量會(huì)下降，是IPTG毒性導(dǎo)致高濃度時(shí)抑制蛋白的表達(dá)[22]所致。誘導(dǎo)4 h rOnGal-4表達(dá)量最大，這與尼羅羅非魚補(bǔ)體3基因[23]和尼羅羅非魚Galectin-3基因[24]的表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果相似。在28 ℃誘導(dǎo)時(shí)，rOnGal-4可溶性蛋白含量最高，與尼羅羅非魚NCCRP-1基因[25]和人β2微球蛋白[26]的結(jié)果一致?？赡茉蚴窃?7 ℃時(shí)大腸桿菌處于最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，合成蛋白的速度快，導(dǎo)致蛋白來不及折疊形成包涵體。用最佳表達(dá)條件下誘導(dǎo)，所得rOnGal-4可溶性蛋白可被成功表達(dá)和純化。本研究可為后續(xù)大量獲取該蛋白制作多克隆抗體和為后續(xù)該蛋白的功能研究奠定基礎(chǔ)。

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Prokaryotic Expression and Optimization ofGene from Nile Tilapia ()

ZHANG Zhi-qiang, LIU xin-chao, NIU Jin-zhong, HUANG Yu, WANG Bei, JIAN Ji-chang

(////,524088,)

【】To study the optimization conditions for prokaryotic expression of the Nile tilapia ()gene , and perform functional studiesof Galectin-4.【】A pair of primers were designed based on the tilapiagene sequence (Genbank: XM-019345120), and to expression plasmid (pGEX-4T-OnGal-4) was produced. The Galectin-4 recombinant clone was induced to express rOnCal4 in BL21 cells and the expression conditions were optimized .【】Thegene was successfully amplified and the prokaryotic expression plasmid pGEX-4T-OnGal-4 was constructed. The optimal induction conditions for rOnGal-4 production were 0.4 mmol/L of IPTG at 28 ℃ for 4 h. The rOnGal-4 protein was highly expressed under the optimized expression conditions. Western-blot results showed that the rOnGal-4 could specifically react with GST-tag monoclonal antibody.

;; gene clone; prokaryotic expression; condition optimization

Q78；Q959.223+.63

A

1673-9159（2020）05-0118-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.015

2020-03-05

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31702386）；廣東省科技廳國(guó)際科技合作領(lǐng)域項(xiàng)目（2017A050501037）；廣東省普通高校青年創(chuàng)新人才類項(xiàng)目（2018KQNCX105）

張志強(qiáng)（1997－），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗镝t(yī)學(xué)。E-mail:248798423@qq.com

簡(jiǎn)紀(jì)常（1964－），博士，教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害防治。E-mail：jianjc@gdou.edu.cn

黃瑜（1986－），博士，講師，研究方向?yàn)轸~類免疫學(xué)。E-mail: huangyu@gdou.edu.cn

張志強(qiáng)，劉鑫潮，牛金中，等. 尼羅羅非魚Galectin-4基因的原核表達(dá)及誘導(dǎo)條件優(yōu)化[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，40（5）：118-123.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）