王維政，曾澤乾，黃建盛,2，郭志雄，李洪娟，陳 剛,2

低氧脅迫對軍曹魚幼魚抗氧化、免疫能力及能量代謝的影響

王維政1，曾澤乾1，黃建盛1,2，郭志雄1，李洪娟1，陳 剛1,2

（1. 廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東 湛江 524088；2. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室（湛江），廣東 湛江 524025）

【】研究低氧脅迫對軍曹魚 () 幼魚抗氧化、免疫能力和能量代謝的影響。幼魚于 (2.98±0.40) mg/L的低溶氧條件下養(yǎng)殖1周，分別測定其肝臟和肌肉組織的抗氧化、免疫相關酶活力以及能量供應物質。低氧脅迫過程中，幼魚肝臟組織超氧化物歧化酶 (SOD) 活力顯著升高 (< 0.05) 后逐漸下降 (< 0.05)，肌肉組織SOD活力呈波動上升趨勢 (< 0.05)，肝臟和肌肉組織谷胱甘肽過氧化物酶 (GPX) 活力和丙二醛 (MDA) 含量均顯著升高 (< 0.05)后，呈逐漸下降趨勢，肝臟組織過氧化氫酶(CAT) 先降(< 0.05) 后升至正常水平，肌肉組織CAT活力先升(< 0.05) 后呈下降趨勢；肝臟組織堿性磷酸酶(AKP) 活力先降后升高(< 0.05)，隨后恢復至與對照組水平(> 0.05)，肝臟酸性磷酸酶(ACP) 活力先顯著上升(< 0.05)，隨后恢復至正常水平(> 0.05)；肌肉組織和肝臟組織乳酸脫氫酶(LDH) 活力變化趨勢一致，均為先顯著升高(< 0.05)，之后呈降低趨勢；肝糖原在低氧脅迫后呈先下降（< 0.05），后恢復至對照組水平(> 0.05)，肌糖原各時間點含量無顯著性差異(> 0.05)。軍曹魚幼魚在低氧脅迫后發(fā)生氧化損傷，刺激自身免疫系統(tǒng)，通過調整相關酶活力及能量代謝的方式提高其適應低氧的能力。

軍曹魚；低氧脅迫；抗氧化；免疫；能量代謝

近年來，隨著氣候變化和污染加劇，水體富營養(yǎng)化頻頻發(fā)生，水體缺氧問題日益嚴重，我國多個近岸海域均發(fā)現(xiàn)有缺氧或低氧現(xiàn)象[1]。水體溶氧對魚類生長、發(fā)育、代謝、行為等有關鍵性作用[2-3]。魚類暴露在低氧環(huán)境時，機體會產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，如不及時消除，則誘導機體發(fā)生細胞凋亡、脂質氧化、組織損傷、DNA和蛋白質降解[4-5]，造成氧化損傷。為此，多數(shù)魚類長期以來已發(fā)展出各種策略以適應低氧環(huán)境，包括調節(jié)紅細胞增殖、抑制紅細胞凋亡、刺激血管生成等增加氧氣輸送和改變代謝效率、減少消耗能量的生物合成途徑等減少機體耗氧量策略[6]。

軍曹魚() 又稱海鱺、海龍魚等，隸屬鱸形目鱸亞目軍曹魚科軍曹魚屬，主要分布于太平洋(東太平洋除外)、大西洋和印度洋等熱帶水域，我國沿海也有分布，為暖水性海洋魚類[7]。其生長速度極快，營養(yǎng)豐富，抗病力強，有較高的經(jīng)濟價值，是海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖中最具養(yǎng)殖前景的魚類之一，且隨著大規(guī)模種苗生產(chǎn)技術的成熟，逐漸成為我國南方海水養(yǎng)殖中最重要經(jīng)濟魚類之一[8]。目前，關于軍曹魚的研究主要集中在生長、營養(yǎng)和代謝等方面，而低氧脅迫方面的研究報道較少，郭志雄等[9]和黃建盛等[10]分別研究了急性低氧脅迫對大規(guī)格軍曹魚幼魚氧化應激、能量代謝、糖代謝和血液生化指標的影響，以及李洪娟等[11]研究了軍曹魚幼魚對低氧-復氧后氧化應激和能量利用的響應，但這些研究均為急性低氧脅迫方面，而關于慢性低氧脅迫方面的研究還未見報道。筆者以低氧脅迫一周為條件，研究軍曹魚幼魚在低氧脅迫下抗氧化、免疫能力及能量代謝的變化情況，為軍曹魚的低氧適應機制以及耐低氧新品種選育提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

軍曹魚為廣東海洋大學東海島海洋生物研究基地繁育的幼魚。幼魚運回實驗室后，于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)（自行設計）暫養(yǎng)1周。養(yǎng)殖系統(tǒng)主要包括養(yǎng)殖水槽模塊、顆粒物去除模塊、氨氮去除模塊、供氣設備、回水管道等。其中，水槽規(guī)格為70 cm × 50 cm × 60 cm，單個水槽運行水體175 L，頂部一側以PVC管進水，另一側設溢水出水孔，24 h內(nèi)水體經(jīng)系統(tǒng)可交換12次(約90 L/h)。暫養(yǎng)期間水溫(26±1)℃，鹽度28 ~ 30，pH 7.8±0.2，持續(xù)充氣，自然光周期，每天8:00、16:00各投喂1次，投喂1 h后及時清除殘餌和糞便，實驗前停飼1 d。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計 挑選體質健康、活力良好、體質量(12.52±1.32) g的軍曹魚幼魚90尾，隨機放入3個水槽，每個水槽30尾，進行低氧脅迫實驗。關閉流水以及氣石，用薄膜封蓋水槽，在1 h內(nèi)將水體溶氧自然降至接近3 mg/L，隨后通過控制水流量及充氣量維持該溶氧水平，調整3 h后開始計時，進行為期1周的低氧脅迫實驗。實驗期間用溶氧儀(臺灣衡欣，AZ8403型) 實時監(jiān)控溶氧水平，通過化學碘量法(GB7489-87) 校正溶氧儀讀數(shù)，水體溶氧為(2.98±0.40) mg/L。其他環(huán)境條件及投喂方式與暫養(yǎng)一致。

1.2.2 樣品采集 在低氧脅迫前（0 d）及脅迫1、4、7 d時取樣，以脅迫前樣品為對照組，每水槽每個時間點取魚3尾，用100 mg/L MS-222海水溶液麻醉，逐尾剖取肝臟和肌肉組織，分別放入2 mL凍存管，迅速置于液氮中，置－80℃冰箱保存，待測。

1.2.3 酶活力與含量的測定 取軍曹魚肝臟、肌肉組織，分別按每克待測組織加入9 mL生理鹽水的比例在冰水浴條件下用勻漿機制備成勻漿液，將勻漿液在4℃、2 000 r/min條件下離心10 min，取上清液分裝于2 mL離心管，放入4 ℃冰箱保存，用于酶活力，蛋白質、肝糖原及肌糖原含量的測定。

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、乳酸脫氫酶(LDH) 活力，丙二醛(MDA)、肝糖原、肌糖原、蛋白質含量均采用VICTOR NivoTM酶標儀（鉑金埃爾默，美國，型號：HH359400031）測定，所用試劑盒購于南京建成生物科技有限公司。按照試劑盒說明書，SOD活力(U/mg) 采用羥胺法測定；CAT活力(U/mg) 采用鉬酸銨法測定；GPX的活力(U/mg) 采用比色法測定；ACP或AKP的活力(金氏單位/g) 采用微板法測定；LDH活力(nmol/g) 采用微板法測定；MDA含量(nmol/mg) 的測定采用TBA法；糖原含量(mg/g) 采用比色法測定；蛋白質含量(g/L) 采用考馬斯亮藍法測定。所測指標分別重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示，用SPSS 19.0對所得的實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，不同時間點的數(shù)據(jù)進行Duncan氏多重比較，< 0.05時差異顯著，< 0.01時差異極顯著。

2 結果

2.1 低氧脅迫對軍曹魚幼魚氧化應激指標的影響

由圖1a和c可知，隨著脅迫時間的延長，肝臟SOD和GPX活力變化趨勢一致，先升高后下降，且1 d時顯著高于對照組(<0.05)，CAT活力在1 d時顯著下降(<0.05) (圖1b)，之后恢復至正常水平，MDA含量在1 d時極顯著升高(<0.01)，隨后顯著下降(< 0.05)（圖1d）。

凡含一個相同字母表示組間差異不顯著（> 0.05）

The data with a same letter indicate no significant difference between groups(> 0.05)

圖1 低氧脅迫對軍曹魚幼魚肝臟SOD、CAT、GPX及MAD活性的影響

Fig. 1 Effects of hypoxic on the activity of SOD, CAT and GPX and the content of malondialdehyde in liver of juvenile cobia

由圖2a可知，隨著脅迫時間的增加，肌肉SOD活力呈上升趨勢，在1、4、7 d時活力均顯著高于對照組(<0.05)，CAT、GPX活力，MDA含量均呈先升后降的趨勢，CAT在1、4 d時顯著高于對照組(< 0.05) (圖2b)，GPX在1、4、7 d時均顯著高于對照組(< 0.05)（圖2c），MDA在1、4 d時顯著升高(< 0.05)，7 d時降至正常水平（圖2d）。

2.2 低氧脅迫對肝臟組織堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的影響

由圖3a可知，低氧脅迫1 d時，肝臟AKP活性顯著下降，4 d時顯著上升并高于對照組，隨后在7 d時下降到對照組水平；肝臟ACP活性表現(xiàn)為先升高后下降，1 d時顯著高于對照組(< 0.05)，之后降至對照組水平(> 0.05) (圖3b)。

2.3 低氧脅迫對軍曹魚幼魚能量代謝指標的影響

圖4a顯示，低氧脅迫后肝臟LDH活力在1 d時顯著上升(< 0.05)，隨后下降，與對照組差異無統(tǒng)計學意義(> 0.05)；肝糖原含量在1、4 d時顯著下降并在4 d時最低(< 0.05)，7 d時與對照組無顯著差異(> 0.05) (圖4b)。

凡含一個相同字母表示組間差異不顯著（P > 0.05）

凡含一個相同字母表示組間差異不顯著（P > 0.05）

凡含一個相同字母表示組間差異不顯著（P > 0.05）

圖5a顯示，低氧脅迫4 d時肌肉LDH活力顯著增大(< 0.05)，其他時間點與對照組無顯著性差異(> 0.05)；低氧脅迫后，肌糖原含量平均值先降后升，但各時間點與對照組無顯著性差異(> 0.05)（圖5b）。

凡含一個相同字母表示組間差異不顯著（P > 0.05）

3 討論

3.1 低氧脅迫對軍曹魚幼魚氧化應激的影響

在常氧狀態(tài)下，ROS的產(chǎn)生和消除處于一種動態(tài)平衡，當魚類受低氧脅迫時，體內(nèi)的黃嘌呤脫氫酶可轉化為黃嘌呤氧化酶，線粒體電子傳遞鏈載體失活，魚體則產(chǎn)生大量的ROS[12-13]，造成ROS的生成速率超過消除速率，發(fā)生氧化應激。為盡量減少ROS對機體的損傷，魚類等需氧生物已進化出、一套抗氧化防御系統(tǒng)，如SOD、CAT和GPX等抗氧化酶[14]。SOD將O2-轉化為H2O2，H2O2隨后被CAT分解為H2O和O2，于是SOD-CAT就形成了魚類對抗氧化損傷的第一道防線，而GPX則將H2O2和有機過氧化物轉化為H2O，它們在維持自由基平衡和減少氧化損傷方面發(fā)揮著重要作用[15]。

在本研究中，低氧脅迫1 d時肝臟SOD和GPX活力顯著增加，CAT活力顯著下降，肌肉三種抗氧化酶活力均顯著上升，表明軍曹魚在低氧脅迫1 d后機體處于氧化應激的狀態(tài)，組織受到損傷，啟動抗氧化防御體系來清除過量產(chǎn)生的ROS，這在斑馬魚()[16]的研究得以印證，其在3 mg/L的低氧脅迫后也引起內(nèi)臟團的SOD和GPX活力升高，而在本實驗室前期實驗中，大規(guī)格軍曹魚幼魚在急性低氧脅迫后肝臟SOD和GPX活力卻顯著降低[9]，原因可能是脅迫的時間和低氧條件的不同，導致了結果的差異。對于低氧脅迫后肝臟CAT活力下降的情況，在河川沙塘鱧() 的研究中亦有肝臟CAT活力降低的現(xiàn)象，可能的原因是該時段肝臟產(chǎn)生過多的ROS，反過來抑制了CAT活性[17]，此外，SOD產(chǎn)生的H2O2主要由CAT清除，SOD活力顯著增高，產(chǎn)生了大量的H2O2，也可能會抑制CAT的活性，導致該時段CAT活力顯著低于對照水平。

在低氧脅迫4 d時，肝臟SOD活力仍顯著高于對照組，肌肉三種抗氧化酶也顯著高于對照水平，說明軍曹魚在脅迫4 d時仍處于氧化應激狀態(tài)，但肝臟和肌肉抗氧化酶均有恢復至對照水平的變化趨勢，當?shù)脱趺{迫持續(xù)7 d時，肝臟CAT和GPX活性以及肌肉CAT活性已恢復至對照水平，說明軍曹魚可通過自身的調節(jié)逐漸適應低氧脅迫，該結果與瓦氏黃顙魚()[13]在急性低氧脅迫后肝臟抗氧化酶活性先升高后下降的結果類似，但與大口黑鱸()[18]的結果有所不同，大口黑鱸在低氧脅迫后其肝臟SOD活性持續(xù)顯著低于對照組，而CAT和GPX活性則表現(xiàn)為先顯著高于對照組，后顯著低于對照水平，對此，有研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導的氧化應激是一種物種和組織特異性的現(xiàn)象[19]，不同魚類對低氧脅迫的應激反應會有所不同。

MDA是自由基和多不飽和脂肪酸反應產(chǎn)生的環(huán)氧化合物，對魚類的物質和能量代謝以及信息的傳遞產(chǎn)生影響，可作為氧化應激的一個指標[20]。本研究中，肝臟和肌肉MDA含量的變化趨勢一致，均在1 d時顯著上升，表明軍曹魚因低氧脅迫而受到脂質過氧化的損傷，與褐牙鲆()[21]研究結果相似，在溶氧不斷下降的過程中，褐牙鲆幼魚肌肉的MDA含量增加。從抗氧化指標可見，1 d時的肝臟和肌肉抗氧化酶活性顯著增大，表明此時產(chǎn)生的自由基過多，抗氧化酶不能及時清除，導致脂質過氧化的發(fā)生，對肝臟和肌肉產(chǎn)生負面的影響，但隨著時間的延長，MDA含量逐漸下降，說明軍曹魚可在長期低氧脅迫下進行自我調節(jié)，緩解應激狀態(tài)。

此外，PILLET等[22]研究表明，肝臟對活性氧誘導的氧化應激最為敏感，本研究中，低氧脅迫后肝臟酶活力及MDA含量均明顯高于肌肉，與文獻[22]結果一致，說明肝臟最易受到氧化應激的損傷。

3.2 低氧脅迫對軍曹魚幼魚肝臟堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的影響

溶酶體可通過水解細菌細胞壁組分來清除細菌，因此常用作水生生物功能防御和健康狀況的標志物，其對應激所產(chǎn)生的ROS極為敏感，一旦ROS過量產(chǎn)生，則溶酶體膜通透性降低，釋放堿性磷酸酶(AKP) 和酸性磷酸酶(ACP) 等酶類[23]。后二者在魚類免疫應答和多種代謝中起重要作用[24-25]，當面臨外界環(huán)境壓力時，會產(chǎn)生ACP和AKP以降解外來物質。舌鰨（）[26]、大黃魚（）[27]的研究中，與對照組相比，鹽度的波動或降低鹽度可顯著提高舌鰨肝臟、大黃魚腎臟ACP和AKP活性。這意味著機體抵御外界物質能力以及代謝能力增強，提供更多的能量來維持自身的穩(wěn)態(tài)。本研究中，軍曹魚幼魚在低氧脅迫期間，肝臟AKP和ACP活性分別在脅迫4 d和1 d顯著升高，表明低氧作為一種環(huán)境應激因子，刺激軍曹魚的免疫應答，增強了免疫防御能力，同時也增強了代謝強度。此外，雖然AKP活性在7 d的低氧脅迫過程中整體上升，但是在脅迫1 d時的活性卻顯著下降，參考鯉()[25]在百草枯脅迫1 d時也出現(xiàn)AKP活性下降的情況，并結合本實驗抗氧化酶活性結果，推測原因可能是，脅迫1 d 時ROS大量產(chǎn)生，造成軍曹魚的先天性免疫功能紊亂以及ROS抑制了AKP的活性。

3.3 低氧脅迫對軍曹魚幼魚能量代謝的影響

脊椎動物糖原代謝是其獲取能量的重要途徑，對維持機體的能量代謝和重要功能物質的合成有重要作用[28]。研究表明，缺氧與厭氧代謝的激活有關[29]，魚類在低氧脅迫后肝糖原和肌糖原的含量會發(fā)生顯著下降，說明在魚類低氧應激過程中通過改變自身代謝途徑的方式為機體提供能量[30]。本研究中，肝糖原在脅迫1、4 d時顯著下降，說明在這期間，軍曹魚幼魚為應對低氧環(huán)境啟動厭氧糖酵解，大量分解糖原，以維持血糖的濃度。當脅迫持續(xù)到7 d時，肝糖原含量恢復到正常水平，說明隨時間的延長，軍曹魚幼魚通過各種生理生化調節(jié)，逐漸適應低氧環(huán)境，代謝趨于正常。另外，本研究可見，肌糖原含量僅平均值下降，與對照組無顯著性差異，與大口黑鱸[31]和花鱸()[28]的研究結果類似，大口黑鱸和花鱸在低氧脅迫后肌糖原均未表現(xiàn)出顯著的變化，原因可能是肝臟作為低氧脅迫主要的代謝器官，肝糖原的分解提供了大部分的能量，肌糖原僅參與小部分機體能量供應。

乳酸脫氫酶(LDH) 可催化丙酮酸與乳酸間的相互轉化，其活性與組織內(nèi)的氧分壓密切相關，在低氧條件下活性增高，促進厭氧糖酵解，產(chǎn)生的乳酸反過來又會提高LDH的活性，因此，LDH活性一定程度上可反映厭氧呼吸水平[32]。本研究中，脅迫1 d時肝臟LDH活性顯著升高，說明機體正在進行厭氧呼吸，且隨著糖原含量的減少，肝臟糖異生作用被激活，以供應厭氧代謝所需的能量，因此，在缺氧過程中產(chǎn)生乳酸作為糖異生底物，刺激LDH活性，將乳酸轉化為丙酮酸，生成葡萄糖，在郭志雄等[9]和黃建盛等[10]的研究中也出現(xiàn)了類似的結果，軍曹魚幼魚在急性低氧脅迫后肝臟和血清LDH活性均顯著升高。而肌肉LDH在脅迫1 d時無顯著變化，在4 d時顯著上升，也說明肌肉并非低氧過程中供應能量的主要組織，但隨著脅迫時間的增加，積累的乳酸也導致其LDH活性上升。

4 結論

軍曹魚幼魚在低氧脅迫后發(fā)生氧化損傷，刺激自身免疫系統(tǒng)，通過調整相關酶活力及能量代謝的方式提高其適應低氧的能力。

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Effects of Hypoxia Stress on Antioxidation, Immunity and Energy Metabolism of Juvenile Cobia,

WANG Wei-zheng1, ZENG Ze-qian1, HUANG Jian-sheng1,2, GUO Zhi-xiong1, LI Hong-juan1, CHEN Gang1,2

（1.,524025,; 2.(),524025,）

【】To investigate the effect of hypoxia on antioxidant , immunity and energy metabolism of juvenile cobia. 【】,a 7-day hypoxia (2.98±0.40 mg/L) experiment was conducted, and the enzymes of antioxidant, immunity and the energy metabolism in liver and muscle were monitored. 【】The activity of superoxide dismutase (SOD) increased significantly (<0.05) and then decreased in liver while significantly increased (<0.05) in muscle after hypoxia stress. The activities of glutathione peroxidase (GPX) and the content of malondialdehyde (MDA) in both liver and muscle increased significantly (<0.05) and then decreased. However, the activities of catalase (CAT) increased significantly (<0.05) and then decreased in muscle, whereas it is decreased significantly (<0.05) and then increased in liver. Alkaline phosphatase (AKP) activity in liver decreased significantly (<0.05) at first and then increased significantly (<0.05), and eventually recovered to the level of control, but the activities of acid phosphatase (ACP) presented the opposite trend. The activities of lactate dehydrogenase (LDH) was the same in liver and muscle, both increased significantly (<0.05) and then decreased. In addition, the content of glycogen in liver declined (<0.05) after hypoxia stress, then recovered to the level of the control (>0.05). but the content of muscle glycogen had no significant difference (>0.05) in different time. 【】The juvenile cobia encountered oxidative damage after hypoxia stress, which stimulated the immune system and improved its ability to adapt to hypoxia byregulating the activity of relevant enzymes and energy metabolism.

; hypoxia; antioxidant; immune; energy metabolism

S965.399

A

1673-9159（2020）05-0012-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.002

2019-11-29

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系專項資金資助(CARS-47)；廣東海洋大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(CXXL2018131)；南方海洋科學與工程廣東省實驗室(湛江)(ZJW-2019-06)；2018年廣東海洋大學起航計劃項目(QHJHZR201818)

王維政（1995―），男，碩士研究生，主要研究方向海水魚類養(yǎng)殖生理生態(tài)學。E-mail: 1029588896 @qq.com

黃建盛，副教授，主要研究方向海水魚養(yǎng)殖生理生態(tài)學。E-mail：huangjs@gdou.edu.cn

陳剛，教授，主要研究方向海水魚養(yǎng)殖生理生態(tài)學。E-mail：cheng@gdou.edu.cn

王維政，曾澤乾，黃建盛，等. 低氧脅迫對軍曹魚幼魚抗氧化、免疫能力及能量代謝的影響[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（5）：12-18.

（責任編輯：劉慶穎）