王增陽，徐 浩，鄭 濤，劉中信，徐佳慧，范華英*

（煙臺大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、 分子藥理和藥物評價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（煙臺大學(xué)），山東 煙臺 264005）

狼瘡性腎炎（Lupus Nephritis，LN）是一種由系統(tǒng)性紅斑狼瘡引起的自身免疫性疾病。腎小球系膜細(xì)胞的過度增殖是LN中最嚴(yán)重的病理表現(xiàn)之一[1]。長正五聚體蛋白3（Pentraxin 3，PTX3）與LN的發(fā)病相關(guān)，在LN患者的血清中表達(dá)升高[2]。目前臨床上治療LN的藥物仍會引起嚴(yán)重的毒副作用，因此尋找新的治療藥物是目前亟待解決的問題。丹酚酸A提取自丹參，具有良好的抗炎抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用[3]。本研究通過TNF-α誘導(dǎo)系膜細(xì)胞過度增殖，檢測丹酚酸A對系膜細(xì)胞過度增殖的影響，并初步評價(jià)其作用機(jī)制。

1 材料與試劑

腎小球系膜細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫（BNCC341134）。丹酚酸A由山東靶點(diǎn)藥物研究有限公司提供。TNF-α購自Sigma公司。MTT購自碧云天生物技術(shù)研究所。PTX3 ELISA試劑盒購自R＆D Systems。NF-κB p65，IκBα抗體購自Santa Cruz Biotechnology Inc。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT法檢測丹酚酸A對TNF-α誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞過度增殖的影響

以每孔8000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，設(shè)置對照組、TNF-α組、TNF-α＋不同濃度丹酚酸A干預(yù)組。除正常組外，其他各組均加入TNF-α（10 ng/mL），在24 h后加入不同濃度的丹酚酸A培養(yǎng)24小時(shí)，每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。加入MTT溶液（濃度為5 mg/mL）孵育4 h。去除上清，再加入150 μL DMSO溶解甲瓚。在波長為570 nm處測量吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.2 ELISA法檢測丹酚酸A對TNF-α誘導(dǎo)的PTX3表達(dá)的影響

按上述分組處理細(xì)胞，收集上清液，根據(jù)PTX3酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書檢測PTX3的表達(dá)情況。

2.3 Western-Blot法檢測丹酚酸A對NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

按上述分組處理細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，然后進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂奶粉封閉，用TBST洗膜后孵育一抗4℃過夜。TBST洗膜后孵育二抗室溫孵育，顯影檢測蛋白條帶。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 丹酚酸A顯著抑制腎小球系膜細(xì)胞的過度增殖

MTT檢測結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明丹酚酸A不同濃度組呈劑量依賴性抑制系膜細(xì)胞增殖。

表1 丹酚酸A對TNF-α誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞過度增殖的抑制作用

3.2 丹酚酸A對TNF-α誘導(dǎo)的PTX3表達(dá)的影響

ELISA結(jié)果如圖1所示，丹酚酸A能夠在一定程度上抑制PTX3的表達(dá)，且丹酚酸A 100μM組（P＜0.01）對PTX3表達(dá)的抑制效果明顯優(yōu)于其他兩組。

圖1 丹酚酸A對TNF-α誘導(dǎo)的PTX3表達(dá)的影響

3.3 丹酚酸A對NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Western Blot結(jié)果如圖2所示，與TNF-α組相比，不同濃度丹酚酸A組均可抑制p65的蛋白表達(dá)并且可以提高IκBα蛋白的表達(dá)，且具有顯著性差異。

圖2 丹酚酸A對NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

4 討 論

LN發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，腎小球系膜細(xì)胞異常增殖使LN的病理表現(xiàn)異常復(fù)雜[4]。PTX3產(chǎn)生于炎癥部位，參與炎癥反應(yīng)及免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。在LN患者中，PTX3的過表達(dá)加重了腎損傷[5]。我們猜想丹酚酸A是否可以通過抑制NF-κB信號通路的激活，從而抑制PTX3的表達(dá)。本研究結(jié)果表明丹酚酸A可以通過抑制系膜細(xì)胞的增殖以及NF-κB通路的激活抑制PTX3的表達(dá)，對腎臟具有一定的保護(hù)作用。