孫葉 劉紅 馬輝 單東方 曹宏 包建忠 陳秀蘭 趙國琦

摘要：本研究利用蘭屬植物雜交種轉錄組測序數(shù)據(jù)開發(fā)EST-SSR標記，分析標記的多態(tài)性及蘭屬種質的遺傳多樣性，為蘭屬植物種質資源的創(chuàng)新和分類研究提供參考。結果表明，轉錄組測序分析獲得113 780條Unigene，從中共識別到23 709個SSR位點，SSR位點出現(xiàn)頻率為20.84%。從設計的200對引物中篩選出20對具有多態(tài)性，并且擴增條帶大小與預期相符的EST-SSR標記引物，對48份蘭屬種質材料進行PCR擴增，平均多態(tài)位點數(shù)為3.0，共檢測到81.00個等位基因，平均每對引物檢測到4.05個等位基因。觀測雜合度平均值為0.320 8，期望雜合度平均值為0.507 0;Shannons信息指數(shù)的變化范圍為0.233 8～1.472 4，平均值為0.932 1，多態(tài)信息含量為0.110 3～0.662 2。對4個參試蘭屬植物種群進行遺傳多樣性分析，春蘭和大花蕙蘭的F1雜交種群與大花蕙蘭種群親緣關系較近，與春蘭種群的親緣關系較遠。聚類分析結果表明，遺傳相似系數(shù)為0.72時，48份種質聚成7類，春蘭和大花蕙蘭的F1代雜交種群大多聚入第I類，春蘭種群聚入第V類，第II類、第III類、第IV類、第VII類均為大花蕙蘭種群。

關鍵詞：蘭屬植物;EST-SSR標記;遺傳多樣性;親緣關系

中圖分類號：S682文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）03-0681-08

Development and application of EST-SSR marker in Cymbidium

SUN Ye1，2，LIU Hong2，MA Hui2，SHAN Dong-fang2，CAO Hong2，BAO Jian-zhong2，CHEN Xiu-lan2，ZHAO Guo-qi1

（1.College of Animal Science & Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China;2.Institute of Agricultural Sciences of the Lixiahe District in Jiangsu Province， Yangzhou 225007， China）

Abstract： Expressed sequence tag-simple sequence repeat （EST-SSR） markers were developed based on transcriptome sequencing， the polymorphism of markers and the genetic diversity of Cymbidium germplasms were analyzed in order to provide reference for the innovation and classification of resources. The results showed that 113 780 unigenes were obtained from transcriptome sequencing， a total of 23 709 SSR loci were detected in the unigene with the frequency of 20.84%. In addition， 20 pairs of EST-SSR primers with polymorphism were selected from 200 primers， and the size of amplified bands was in accordance with the expectation. Moreover， 48 Cymbidium germplasms were amplified by PCR， and the average number of polymorphic loci was 3.0. A total of 81.00 alleles were observed， with an average of 4.05 alleles per locus. The mean values of observed heterozygosity and expected heterozygosity were 0.320 8 and 0.507 0， respectively. Shannon′s information index ranged from 0.233 8 to 1.472 4， and the average value was 0.932 1. The polymorphic information content（PIC） ranged from 0.110 3 to 0.662 2. The F1 population of Cymbidium georingii and Cymbidium hybridum was close to the population of C. hybridum， and far away the population of C.georingii. Cluster analysis results indicated that 48 germplasms were grouped into seven groups at the genetic similarity coefficient of 0.72， the F1 population of C.georingii and C. hybridum was grouped into class I， the population of C.georingii was grouped into class V， and class II， class III， class IV and class VII were the population of C. hybridum.

Key words：Cymbidium;expressed sequence tag-simple sequence repeat （EST-SSR） marker;genetic diversity;genetic relationship

蘭屬植物主要分于中國、日本、韓國、馬來群島、印度西北部、澳大利亞北部和東部等國家和地區(qū)，具有很高的觀賞價值和經(jīng)濟開發(fā)價值。蘭屬約有48個原生種，中國有29個，主要分為地生類、附生類和腐生類。春蘭（Cymbidium goeringii）和大花蕙蘭（Cymbidium hybridum）都是蘭屬中重要的種，相關園藝品種十分豐富，市場化開發(fā)程度高。1989年有學者利用中國蘭屬植物獨占春（Cymbidium eburneum）的變種象牙白作母本，碧玉蘭（Cymbidium lowianum）作父本，育成了大花蕙蘭的第一個品種象牙碧玉蘭[1]，后來又利用原產(chǎn)于印度、緬甸、泰國和中國西南部等國家及地區(qū)的許多大花附生原種為親本，雜交獲得了大量蘭屬新品種。隨著產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，國內(nèi)蘭花人工育種的重要方向之一是通過春蘭與大花蕙蘭的種間雜交，改善大花蕙蘭品種無香味、葉型散亂并且在中國南方地區(qū)不易開花以及春蘭花色單一等缺陷，選育出兼具二者優(yōu)點的新種質。目前，春蘭和大花蕙蘭雜交育種產(chǎn)業(yè)在中國才剛起步，種質資源的創(chuàng)新利用及分子標記輔助育種具有十分重要的研究價值。

目前，蘭屬植物的基因組信息還比較匱乏，簡單重復序列（SSR）標記的開發(fā)是豐富蘭屬植物遺傳信息的重要手段，蘭科植物的SSR標記引物在屬內(nèi)、種內(nèi)都有很好的適應性和通用性[2-3]。早期的蘭屬植物研究主要通過基因組富集文庫開發(fā)SSR標記引物，Xia等[4]開發(fā)了9對墨蘭SSR標記引物，并證明其在蘭科植物中有廣泛的適應性;Moe等[5]開發(fā)了14對春蘭SSR標記引物，研究了包含春蘭、墨蘭、大花蕙蘭3個種96份種質的遺傳多樣性;Hyun等[6]利用SSR標記研究了朝鮮、韓國、中國和日本的春蘭種群遺傳多樣性及親緣關系。上述SSR標記的開發(fā)和應用促進了蘭屬植物分類鑒定、遺傳進化等分子生物學研究。隨著測序技術的發(fā)展和測序成本的下降，利用轉錄組測序數(shù)據(jù)開發(fā)的EST-SSR標記在作物研究上被廣泛應用[7-10]，蘭屬植物EST-SSR標記的開發(fā)利用方面也取得了一定進展。李小白等[11-12]利用建蘭轉錄組測序數(shù)據(jù)開發(fā)了62對genic-SSR標記引物，金鳳等[13]采用其中的52對genic-SSR標記引物分析了蘭屬植物5個種的43個品種，發(fā)現(xiàn)品種遺傳背景與地理環(huán)境存在一定聯(lián)系。Huang等[14]利用蝴蝶蘭屬在NCBI公開的表達序列標簽（EST）數(shù)據(jù)，開發(fā)了13對EST-SSR標記引物，對6個種的103個蘭屬植物品種進行遺傳分析，其中聚類分析結果很好地反映出參試品種種間、種內(nèi)遺傳背景的差異。Liu等[15]利用13對EST-SSR標記引物對129個春蘭品種進行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)EST-SSR標記在品種分類和種質鑒定方面實用性較強，43個梅瓣品種中存在CY2-J等位基因，為春蘭梅瓣品種相關功能基因的研究提供了參考。張亞楠等[16]發(fā)現(xiàn)，寒蘭轉錄組測序數(shù)據(jù)開發(fā)的15對EST-SSR標記引物在15個不同地區(qū)的寒蘭中表現(xiàn)出多態(tài)性，可用于寒蘭的遺傳研究。說明，EST-SSR標記在蘭屬植物品種分類、種質鑒定及標記的功能分析等方面有很高的應用價值和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

春蘭和大花蕙蘭雜交育種周期長，優(yōu)良種質的早期篩選能減少工作量，有效提高育種效率。本研究擬利用春蘭和大花蕙蘭雜交種黃金梅的轉錄組測序數(shù)據(jù)開發(fā)EST-SSR標記，以期為春蘭和大花蕙蘭種質資源遺傳多樣性和親緣關系分析評估，雜種優(yōu)勢群體的劃分，雜交種的真實性檢測，園藝性狀遺傳規(guī)律分析以及雜種性狀預測等研究提供參考。

1材料與方法

1.1轉錄組數(shù)據(jù)來源

轉錄組測序樣本是保存于江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所蘭花種質資源圃中的蘭屬雜交種黃金梅，黃金梅是從母本春蘭大宋梅與父本大花蕙蘭黃金虎雜交F1代中選出的新品系，取其花蕾期淡黃綠色花萼和始花期紫紅色花萼，提取RNA后委托上海為青生物科技有限公司進行轉錄組測序，獲得113 780條Unigene。

1.2植物材料

參試的48份種質材料（表1）取自江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所花卉課題組蘭花種質資源圃，包括14份（序號1～14）春蘭大宋梅與大花蕙蘭黃金虎雜交F1代種群（CH）、11份（序號15～25）大花蕙蘭種群（DH）、10份（序號27～36）春蘭新春梅與大花蕙蘭紅霞雜交F1代種群（XH）、13份（序號26、序號37～48）春蘭種群（CL）。

CH：春蘭大宋梅與大花蕙蘭黃金虎雜交F1代種群;XH：春蘭新春梅與大花蕙蘭紅霞雜交F1代種群;DH：大花蕙蘭種群;CL：春蘭種群。

1.3DNA提取

選取葉長10 cm以上當年新生葉片，采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取基因組DNA，提取液使用前加入2%的β-巰基乙醇。利用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA純度及質量濃度，稀釋至25 ng/μl，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4EST-SSR位點篩選和引物設計

利用MISA工具對Unigene進行SSR位點搜索分析，SSR篩選標準為：單核苷酸重復次數(shù)至少為10次，二核苷酸重復次數(shù)至少為6次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復次數(shù)至少為5次。利用Primer 3.0引物設計軟件為含有SSR位點的Unigene設計引物，設計原則為：引物序列長度18～24 bp，預計擴增產(chǎn)物大小100～600 bp，G+C含量40%～70%，退火溫度55～57 ℃，上、下游引物的退火溫度值相差不大于2 ℃，獲得引物后比對Unigene，引物兩端不允許錯配。隨機選取200對EST-SSR標記引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.5引物篩選

將編號為CH-2、CH-10、DH-8、DH-9、XH-1、XH-10、CL-3、CL-10的8份種質中提取的DNA等量混合，進行引物篩選。PCR反應體系為12.00 μl，其中25.0 ng/μl DNA 2.00 μl，10×PCR buffer 1.20 μl，25.0 mmol/L Mg2+ 1.50 μl，10 μmol/L引物Primer-F和Primer-R各1.00 μl，0.5 U/μl aq DNA聚合酶1.00 μl，2.5 mmol/L dNTPs 0.75 μl，剩余用雙蒸水補足。試驗所用藥品、試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。PCR擴增程序為：95 ℃預變性2.0 min，35個循環(huán)（94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃延伸10 min，退火溫度由EST-SSR標記引物決定。擴增產(chǎn)物采用8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，120 V電壓下電泳90 min，銀染顯色，在可見光燈箱中進行觀察、拍照和讀帶。

1.6PCR擴增和數(shù)據(jù)分析

依據(jù)篩選出的引物，對48份材料進行PCR擴增，統(tǒng)計目的擴增條帶，根據(jù)分子量大小依次記載，缺失數(shù)據(jù)記載為99，計算多態(tài)位點數(shù)及多態(tài)率。用POP-GENE32軟件分析擴增位點和種群的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、Shannons信息指數(shù)、基因分化系數(shù)、基因流、Neis基因多樣度、Neis遺傳距離、Neis遺傳一致度。利用PIC Calc 0.6軟件計算各引物的多態(tài)性信息含量（PIC）。將基因型數(shù)據(jù)轉為（0，1）數(shù)據(jù)模式，使用NTSYSpc 2.10軟件以非加權組平均法（UPGMA）對48份種質進行聚類分析。

2結果與分析

2.1蘭屬雜交種黃金梅轉錄組中SSR位點的數(shù)量與分布

黃金梅轉錄組113 780條Unigene中共識別到23 709個SSR位點，分布在18 548條Unigene中，SSR的發(fā)生頻率（含有SSR的Unigene數(shù)目與總Unigene數(shù)目的比值）為16.30%，SSR位點出現(xiàn)頻率（檢出的SSR數(shù)目與總Unigene數(shù)目的比值）達20.84%。包含1個以上SSR位點的Unigene有3 968條，含有復合型SSR位點的Unigene有2 310條。

轉錄組鑒定出6種重復類型的EST-SSR（表2），從單核苷酸到六核苷酸均存在，其中單核苷酸、雙核苷酸、三核苷酸重復數(shù)量較多，分別占總SSR的59.69%、27.56%和11.79%;四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復數(shù)量較少，分別占總SSR的0.71%、0.13%和0.12%，單核苷酸重復到六核苷酸重復的EST-SSR數(shù)量呈遞減趨勢。

2.2EST-SSR標記引物的篩選

以編號為CH-2、CH-10、DH-8、DH-9、XH-1、XH-10、CL-3、CL-10 8份材料基因組DNA為模板，對隨機篩選出的200對EST-SSR標記引物進行PCR擴增，擴增標記清晰度較好的引物有115對，擴增效率為57.5%。利用粗篩引物對48份蘭屬種質材料進行PCR擴增，其中104對引物擴增出了PCR產(chǎn)物，可分為3類，第一類為擴增產(chǎn)物與預期長度相符合的特異性標記（圖1A）;第二類為非特異性標記（圖1B），其中某些非特異性標記能清楚地對參試種質進行劃分;第三類為無多態(tài)性的特異性標記。根據(jù)擴增結果選出20對具有多態(tài)性，條帶清晰，重復性較好，并且所得擴增條帶大小與預期相符的引物。

2.3EST-SSR標記的多態(tài)性和遺傳多樣性分析

統(tǒng)計篩選出的20對EST-SSR標記引物在48份蘭屬種質中的特異性擴增條帶，結果（表3）顯示，擴增條帶大小為149～341 bp。20對引物在48份材料中共檢測到63個位點，其中多態(tài)性位點60個，位點多態(tài)率（PPL）平均值為94.58%。20對EST-SSR標記引物共檢測到81.00個等位基因，平均每對引物檢測到4.05個等位基因，平均有效等位基因數(shù)為2.178 9。多態(tài)性信息含量為0.110 3～0.662 2，平均值為0.453 6，其中9個位點表現(xiàn)為高度多態(tài)性（PIC≥0.500 0），10個位點表現(xiàn)為中度多態(tài)性（0.250 0

2.4不同種群遺傳多樣性分析

對4個參試種群進行遺傳多樣性指數(shù)分析，結果（表4）顯示，4個種群觀測雜合度平均值為0.327 3，期望雜合度平均值為0.433 7，期望雜合度均大于觀測雜合度，說明各種群內(nèi)均存在一定程度的近交。DH種群的等位基因數(shù)為3.35，Neis基因多樣度為0.509 5，Shannons信息指數(shù)為0.913 5，期望雜合度為0.533 8，PIC為0.483 7，均高于其他3個種群，而CH種群的各項指標值均最低。表明，DH種群遺傳多樣性最高，而CH種群遺傳多樣性最低。

=

CH、XH、DH、CL見表1注。

2.5種群間的Neis遺傳距離和Neis遺傳一致度

利用EST-SSR標記分析4個種群兩兩之間的Neis遺傳距離（GD）和Neis遺傳一致度（GI），結果（表5）表明，種群間的Neis遺傳距離為0.114 9～0.301 2，Neis遺傳一致度為0.739 9～0.891 5，4個種群的遺傳相似度較高，遺傳分化較小。CH種群與XH種群的Neis遺傳距離最小，親緣關系最近。CH種群、XH種群與CL種群的Neis遺傳距離較大，親緣關較遠，CH種群、XH種群與DH種群的Neis遺傳距離較小，親緣關較近?；贜eis遺傳一致度的4個種群聚類圖（圖2），春蘭與大花蕙蘭的雜交F1種群與大花蕙蘭種群親緣關系較近，與春蘭種群的親緣關系較遠。

2.648份種質的聚類分析

利用NTSYSpc 2.10分析軟件計算48份參試種質間的杰卡德相似系數(shù)，并制作UPGMA聚類圖。圖3顯示，本研究開發(fā)的EST-SSR標記能區(qū)分參試的48個蘭屬種質，在遺傳相似系數(shù)為0.72時，48個種質聚成7類，除CH-3、XH-9外，CH和XH種群的其他22份材料聚為第Ⅰ類，第Ⅱ類、第Ⅲ類、第Ⅳ類、第Ⅶ類均為大花蕙蘭種群，第Ⅴ類除XH-9外均為春蘭種群。 在遺傳相似系數(shù)為0.78時，第Ⅰ類又分為3大亞類，一個亞類主要為CH種群，另外兩個亞類為XH種群。

CH-1至DH-1見表1。

3討論

3.1蘭屬植物EST-SSR標記開發(fā)

本研究中，春蘭和大花蕙蘭雜交種的轉錄組測序數(shù)據(jù)共識別出23 709個SSR位點，位點出現(xiàn)頻率為20.84%，其中單核苷酸重復占59.69%，雙核苷酸重復占27.56%，三核苷酸重復占11.79%，四核苷酸重復占0.71%，五核苷酸重復占0.13%，六核苷酸重復占0.12%，單核苷酸、雙核苷酸、三核苷酸重復數(shù)量較多。李小白等[11]利用建蘭鐵骨素花器官測序的轉錄組數(shù)據(jù)，SSR位點出現(xiàn)頻率為17.54%，各SSR類型中單核苷酸重復占比最高（55.40%），單核苷酸、雙核苷酸、三核苷酸重復占比97.84%;張亞楠等[16]利用寒蘭根、莖、葉、花4部分組織總RNA測序的轉錄組數(shù)據(jù)，共識別出9 837個SSR位點，位點出現(xiàn)頻率為14.32%，各SSR類型中雙核苷酸重復占比最高（55.22%），單核苷酸、雙核苷酸、三核苷酸重復占比95.08%。

3.2EST-SSR標記多態(tài)性分析

本研究通過轉錄組數(shù)據(jù)設計200對EST-SSR標記引物，115對具有可擴增性，其中20對引物的擴增產(chǎn)物有多態(tài)性且與預期大小相符。引物擴增出非特異性標記的原因，朱根發(fā)等[17]、謝佩吾等[18]認為，一方面可能是EST序列有內(nèi)含子，另一方面可能是基因組DNA含有內(nèi)含子，擴增出具有內(nèi)含子長度的多態(tài)片段，同時還可能與部分大花蕙蘭為非整倍體或多倍體有關。篩選功能標記是EST-SSR標記引物開發(fā)的重要目的之一，有些非特異性標記引物擴增出的特征譜帶能高效區(qū)分親本群體和雜交群體，本研究開發(fā)的EST-SSR標記對雜種后代的鑒定及分子評價作用仍需進一步探索。

本研究中20對EST-SSR標記引物的PIC平均值為0.453 6。李小白等[12]利用建蘭的39對多態(tài)性引物，在12個建蘭品種中進行擴增驗證，PIC平均值為0.348 0。Li等[19]利用開發(fā)的55對genic-SSR引物，在蘭屬植物9個種的63個品種中擴增的標記有多態(tài)性，PIC平均值為0.407 0。金鳳等[13]利用52對genic-SSR引物分析蘭屬植物5個種的43個品種，PIC平均值為0.415 0。陳程[3]利用開發(fā)的4對蝴蝶蘭屬EST-SSR標記引物擴增64個蘭屬植物品種，PIC平均值為0.398 0。這些開發(fā)的蘭屬植物EST-SSR標記均表現(xiàn)為中度多態(tài)性。

3.3蘭屬各種群遺傳多態(tài)性分析及親緣關系分析

對4個參試種群進行遺傳多樣性分析，相對春蘭品種，大花蕙蘭品種的遺傳多樣性較高，這與前人研究結果[5，20-21]一致。遺傳距離和遺傳一致度研究結果表明，4個種群的遺傳相似度較高，遺傳分化較小，這可能與種群間的近交及基因傳遞有一定關系。CH和XH種群均為大花蕙蘭和春蘭的雜交后代，遺傳背景較為一致，因此遺傳距離最近，且遺傳距離與父本大花蕙蘭較近，與母本春蘭較遠，這與朱根發(fā)[20]和魯?shù)蟍21]研究結果一致。

聚類分析[22-23]結果表明，遺傳相似系數(shù)為0.72時，總體上春蘭種群聚為一類，春蘭和大花蕙蘭的雜交種群聚為一類，大花蕙蘭種群分別聚為幾類，這與大花蕙蘭遺傳多樣性較高的遺傳背景一致。XH-9種質聚入春蘭種群，該種質園藝性狀是否與其母本春蘭新春梅更接近，能否實現(xiàn)育種者選育出蘭屬小型色花新品種的育種目標，仍需進一步研究。本研究開發(fā)的EST-SSR標記能區(qū)分參試的48份蘭屬種質，聚類分析結果反映了參試種質的遺傳背景，開發(fā)的EST-SSR標記引物具有實用性，可以擴大應用范圍。

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（責任編輯：王妮）