劉麗麗 張吉麗

摘 要：近年來，siRNA技術(shù)作為一種新型的基因治療手段，對(duì)疾病的治療起著至關(guān)重要的作用，但是siRNA的靶向遞送也面臨巨大的挑戰(zhàn)。設(shè)計(jì)非病毒納米載體用于安全、高效地將siRNA運(yùn)送至靶點(diǎn)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，本文對(duì)目前可遞送siRNA的非病毒納米載體的設(shè)計(jì)進(jìn)行了綜述，并提出了目前存在的問題，及新型載體設(shè)計(jì)的展望。

關(guān)鍵詞：siRNA;遞送系統(tǒng);聚合物;脂質(zhì);多肽;無機(jī)納米顆粒

基因技術(shù)的發(fā)展日新月異，基因藥物的研發(fā)也倍受人們關(guān)注。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）在1998年由Fire等發(fā)現(xiàn)，是一類可以特異性抑制靶基因表達(dá)的雙鏈RNA。隨著對(duì)RNAi的認(rèn)識(shí)不斷深入，2001年Elbashir等證明了合成的雙鏈小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可以使靶基因特異性沉默。RNAi已經(jīng)用于腫瘤、病毒感染、乙型肝炎、癌癥等多種疾病的治療。小干擾RNA（siRNA）是RNAi的效應(yīng)分子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)RNAi效應(yīng)。

siRNA由于其體積小、包封率高以及安全性高等特點(diǎn)，已成為具有廣闊發(fā)展前景的核酸類藥物。雖然siRNA具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，但是在臨床應(yīng)用中仍存在亟待克服的障礙：siRNA在血清中穩(wěn)定性較差，易被RNase降解。21-核苷酸的siRNA相對(duì)較小，即使是經(jīng)化學(xué)修飾保持穩(wěn)定的siRNA分子吸收入血后也易經(jīng)尿迅速排泄。全身給藥后siRNA的非特異性分布會(huì)明顯降低靶組織的局部濃度。siRNA需克服血管內(nèi)皮壁和多重的組織屏障以達(dá)到靶細(xì)胞。當(dāng)siRNA到達(dá)靶細(xì)胞后還必須有效內(nèi)吞、細(xì)胞攝取和保持細(xì)胞內(nèi)RNAi有活性及完整性。siRNA的脫靶效應(yīng)。siRNA的免疫原性刺激。

因此，要將siRNA分子成功導(dǎo)入生物體并發(fā)揮有效的治療作用，首先應(yīng)解決載體問題。大多數(shù)研究的解決方案主要有直接局部給藥、化學(xué)修飾、病毒載體和非病毒載體等多種技術(shù)。在現(xiàn)有的解決方案中，非病毒載體具有低免疫原性、易合成、不受基因大小限制、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，明顯優(yōu)于其他給藥技術(shù)。非病毒載體包括多種載體方式給藥，納米粒載體是由生物材料制備的非病毒載體，粒徑大小在1～1000nm。納米粒在遞送siRNA方面具有很多優(yōu)點(diǎn)，比如提高siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性，具有靶向功能，降低細(xì)胞毒性和免疫原性，增加細(xì)胞攝取和內(nèi)化行為等，這些都有利于提高siRNA的基因沉默效率。因此，文中對(duì)siRNA非病毒納米傳遞載體的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

一、非病毒納米載體分類

非病毒納米載體材料可分為：聚合物類、脂質(zhì)類和多肽類以及無機(jī)納米材料等?，F(xiàn)分別就各類材料中的具體載體設(shè)計(jì)進(jìn)行介紹：

（一）聚合物類

由于siRNA帶負(fù)電，所以帶正電的陽離子聚合物可以通過靜電引力與之結(jié)合，從而完成siRNA的包載。聚合物載體材料又可分為天然高分子聚合物與合成高分子聚合物。

1.天然高分子聚合物。膠原蛋白類是一類天然高分子物質(zhì)，由胃蛋白酶純化而來，具有生物可降解以及良好的生物相容性。Takeshita等人通過將等體積的膠原蛋白與siRNA溶液相混合，制備了一種siRNA/膠原蛋白復(fù)合物，體外試驗(yàn)測(cè)定其具有長循環(huán)特性和癌組織蓄積性，并且無免疫原性

環(huán)糊精（cyclodextrins，CDs）為多聚糖形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有良好的生物相容性，不會(huì)誘發(fā)免疫反應(yīng)，在動(dòng)物和人體中的毒性均較低，顯示出良好的非病毒基因遞送潛質(zhì)。Davis利用環(huán)糊精聚合物所帶的正電荷與siRNA通過靜電作用組裝形成納米粒，成功地將siRNA遞送到靶細(xì)胞中。結(jié)果表明，利用這種新型的基因遞送載體遞送siRNA能夠顯著抑制小鼠轉(zhuǎn)移尤文氏肉瘤的生長速度。

殼聚糖（chitosan）（α（l，4）2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖）是甲殼素脫乙酞化的產(chǎn)物，來源廣泛，是一種天然的、無毒、可生物降解并且低免疫原性的陽離子聚合物。鑒于直接使用殼聚糖作為轉(zhuǎn)運(yùn)載體的遞送效率有限，Tripathi等向殼聚糖骨架引入一個(gè)低分子量的CP1PEI提高了基因轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

2.合成高分子聚合物。該類化合物主要包括聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）及其修飾物、聚丙交酯乙交酯（polylactide-co-glycolide，PLGA）、以及聚酰胺-胺型樹枝狀高分子（polyamidoaminedendrimei，PAMAM）等。

PEI聚乙烯亞胺是研究最廣泛用于系列核酸的遞送載體，分子結(jié)構(gòu)有大量的仲胺基團(tuán)和叔胺基團(tuán)，具有“質(zhì)子海綿效應(yīng)”、高的電荷密度和較強(qiáng)的緩沖能力，能夠保護(hù)核酸免受核酸酶的降解，并能輔助核酸從內(nèi)涵體中釋放。PEI分為分枝狀和線狀兩種類型，分枝狀的轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于線狀;對(duì)于不同分子量的交聯(lián)PEI，低分子量毒性小，但轉(zhuǎn)染率低于高分子量的PEI;轉(zhuǎn)染效率隨著偶聯(lián)的分枝狀PEI數(shù)量增加而增加。PEI作為siRNA載體的機(jī)制為：PEI分子中大量的質(zhì)子化氨基基團(tuán)可以與siRNA形成非共價(jià)的高電解質(zhì)分子復(fù)合物，被細(xì)胞內(nèi)吞后，通過獨(dú)特的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，增強(qiáng)質(zhì)子和水的內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)涵體破裂釋放出siRNA到胞漿。

PLGA聚丙交酯乙交酯是乳酸和乙醇酸通過酯鍵連接的共聚物，在體內(nèi)代謝的最終產(chǎn)物為二氧化碳和水，是一類無毒、生物可降解、生物相容性好的高分子材料。研究表明，影響PLGA納米載體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染的因素有：溶液pH，納米粒子與siRNA的比例等。

PAMAM是一種有規(guī)律的高分散性排列的結(jié)構(gòu)大分子，其結(jié)構(gòu)形狀，表面電荷，分子量大小可以調(diào)整，可以通過內(nèi)部封裝，表面吸附，化學(xué)偶聯(lián)等來裝載藥物，可以用來遞送siRNA。PAMAM的化學(xué)結(jié)構(gòu)表面上有伯胺基，內(nèi)部有叔胺基，可有效控制粒徑在納米級(jí)范圍內(nèi)，而且可引起“質(zhì)子海綿”效應(yīng)，促進(jìn)siRNA在細(xì)胞質(zhì)中釋放。

（二）脂質(zhì)類

脂質(zhì)體（liposome）是在納米水平上高度有序的脂質(zhì)聚合體，一類球形小泡形狀的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，是由磷脂、膽固醇等膜材包合而成，組織相容性好，制備產(chǎn)物釋放容易，是目前廣泛使用的一種siRNA遞送載體。脂質(zhì)體一般包括中性脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)體。

核苷酸脂質(zhì)顆粒（stablenucleicacidlipidparticles，SNALP）即由多種脂質(zhì)構(gòu)成。siRNA的SNALP構(gòu)型現(xiàn)已成功用于小鼠皮下腫瘤的絲/蘇氨酸蛋白激酶（Polo-likekinaselike1PLK1）的沉默研究及食蟹猴的載脂蛋白B（apolipoproteinB，ApoB）沉默研究等多項(xiàng)研究中。利用SNALP來靶向乙型肝炎病毒（HBV），結(jié)果顯示：制得的SNALP中的siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性大大增加，血漿半衰期明顯延長，毒性和免疫刺激等不良反應(yīng)也相應(yīng)減少。

（三）多肽類

因?yàn)槎嚯牡牡投拘?，被廣泛用來用于siRNA的運(yùn)送載體材料。但是，相對(duì)于其他陽離子材料來說，它不能有效的壓縮核酸以及在細(xì)胞質(zhì)中釋放核酸，因此在用作核酸的載體材料時(shí)通?？梢赃x擇性的加以修飾。

來自狂犬病毒糖蛋白（RVG）的短肽使siRNA能夠經(jīng)過血管傳遞到腦部。在RGV肽的羧基末端采用合成的方法接上9個(gè)精氨酸殘基經(jīng)純化、生物素?；玫降腞VG-9R，將其與siRNA在5%的葡萄糖溶液中混合制得RVG-9R/siRNA復(fù)合物。給予綠色熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)基因小鼠尾靜脈注射復(fù)合物后，會(huì)引起特定的外源基因沉默，且只在大腦中發(fā)現(xiàn)了GFP基因沉默現(xiàn)象，而在肝和脾臟中均未發(fā)現(xiàn)，這說明RVG-9R/siRNA復(fù)合物具有腦靶向性，結(jié)果表明：該siRNA傳遞載體很有可能應(yīng)用于病毒性腦炎的治療。

魚精蛋白是人工合成的一段富含精氨酸的蛋白質(zhì)，有很好地抗原結(jié)合能力和轉(zhuǎn)載能力。Peer等構(gòu)建了靶向人淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（LFA-1）的抗體-魚精蛋白融合蛋白，并證實(shí)其能有效轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA并特異誘導(dǎo)沉默效應(yīng);并以類似方法將魚精蛋白-siRNA包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，通過全身給藥途徑，成功抑制了小鼠結(jié)腸炎模型的疾病進(jìn)展。

精氨酸—甘氨酸—天門冬氨酸（RGD）是許多黏附蛋白的高度保守氨基酸序列。Todd等采用第三代納米管接上RGD和PEG間斷共載阿霉素（DOX）和siRNA，制得G3-[PEG-RGD]-[DOX]。結(jié)果顯示：將阿霉素共載于該納米載體后，與游離阿霉素相比，對(duì)惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞顯示出更大的細(xì)胞毒性，該納米載體所載的siRNA相比于裸siRNA顯示出更強(qiáng)的基因沉默效應(yīng)。

（四）無機(jī)納米顆粒

無機(jī)納米顆粒作為siRNA載體能包裹、濃縮、保護(hù)siRNA避免核酸酶的降解，幾乎無毒性，制備簡易，保存方便，比表面積大，具有良好的生物相容性和可降解性，穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的前景。常用的siRNA遞送載體有以下幾種：

金納米顆粒（AuNPs）在用于siRNA遞送載體的過程中，易于被細(xì)胞攝取，且無明顯的細(xì)胞毒性，可直接通過離子作用、共價(jià)鍵或物理吸附作用與藥物、siRNA等相結(jié)合，或通過結(jié)合PEG或其他形成保護(hù)膜的分子，阻止體內(nèi)納米顆粒的聚合，確保給藥后更長的藥物循環(huán)時(shí)間。

單壁納米碳管和多壁納米碳管也是具有應(yīng)用前景的基因靶向遞送材料。Podesta等制備了胺基修飾的MWNT攜帶siRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，成功延長了荷瘤裸鼠的生存期。

Mccarroll等應(yīng)用脂質(zhì)和樹狀聚合物使SWNT功能化，并將其與siRNA形成的復(fù)合物注射于小鼠體內(nèi)，有效沉默ApoB的表達(dá)，且注射后48h80%的復(fù)合物已從體內(nèi)清除，證實(shí)SWNT并未引起siRNA的聚合，也未抑制體內(nèi)的生物降解和藥物清除過程。

盡管無機(jī)納米載體金納米顆粒以及單壁納米碳管和多壁納米碳管等擁有廣闊的應(yīng)用前景，但細(xì)胞毒性也是要克服的問題。采用表面修飾方法可以提高轉(zhuǎn)染效率，降低毒性，使其作為siRNA的非病毒載體成為可能。

二、新材料的構(gòu)想和設(shè)計(jì)

siRNA具有安全性高、免疫原性低、不受基因大小限制、合成快速等優(yōu)點(diǎn)，在遞送過程中，醫(yī)藥工作者們對(duì)于載體開發(fā)方面做了大量的工作，但是我們由以上幾類siRNA的非病毒納米載體的了解中，我們可以看到不同的非病毒納米載體有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，因此，將多種載體聯(lián)合應(yīng)用或者設(shè)計(jì)新型的載體材料勢(shì)在必行。

新近報(bào)道的一種螺旋狀噬菌體外殼蛋白融合肽DMPGTVLP作為獨(dú)特的配體遞送Liposome/siRNA，有較好的靶向性，有望得到廣泛應(yīng)用。YelenaVachutinsky等人曾設(shè)計(jì)了一種聚合物膠束用于靶向新生血管的質(zhì)粒DNA的傳遞，在其基礎(chǔ)上構(gòu)想了一種新的siRNA的載體材料。制備用二硫鍵交聯(lián)的嵌段共聚物膠束，可以提高膠束在細(xì)胞外的穩(wěn)定性，將殼聚糖巰基化，再與聚乙二醇形成共聚物。最后經(jīng)固化交聯(lián)作用形成穩(wěn)定的膠束。由于聚乙二醇與殼聚糖具有良好的生物相容性與生物可降解性，而RGD作為一種整合物受體識(shí)別模塊具有良好的新生血管靶向性，推測(cè)該結(jié)構(gòu)將會(huì)成為一個(gè)比較理想的siRNA的傳遞系統(tǒng)。

三、小結(jié)與展望

siRNA作為一種疾病的治療藥物在研究和應(yīng)用的方面現(xiàn)已經(jīng)取得很大成功，進(jìn)一步深入的研究其機(jī)制，設(shè)計(jì)更加優(yōu)質(zhì)的載體運(yùn)載siRNA是目前醫(yī)藥工作者以及科研人員的努力方向。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展、現(xiàn)代藥劑學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的不斷進(jìn)步，我相信在不久的將來，siRNA體內(nèi)遞送系統(tǒng)的研究工作將會(huì)取得突破性進(jìn)展。

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作者簡介：劉麗麗（1979-）女，講師，研究方向：畜禽養(yǎng)殖及疾病防治。

通訊作者：張吉麗（1992-）女，博士，主要從事抗寄生蟲藥物研發(fā)工作。